支气管哮喘是儿童时期最常见的呼吸道慢性炎症性疾病^[1]。近年来，儿童哮喘发病率呈上升趋势，严重影响了儿童的身心健康^[1-2]。槐杞黄作为一种免疫调节剂，可激发机体免疫系统，提高患儿抵抗非特异性感染的能力^[3-4]，在临床中用于哮喘的辅助治疗和预防，但其对哮喘的作用及机制尚未明确。有研究表明，Th1/Th2功能失衡，Th2细胞优势分化是哮喘的发病机制之一^[5]，而转录因子T-bet和GATA3是决定Th1、Th2细胞亚群分化方向的重要因素^[6]。本研究通过对哮喘大鼠模型应用槐杞黄后，观察其肺组织炎症改变，嗜酸性粒细胞水平及细胞因子变化，Th1、Th2细胞比例变化，以及T-bet和GATA3表达变化，以进一步探究槐杞黄对哮喘的作用及其机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂

SPF级6~8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠40只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于华中科技大学同济医学院动物实验中心SPF动物房内，饲养环境为22~25℃，12 h/12 h昼夜交替，自由饮水及摄食。槐杞黄颗粒（国药准字B20020074，10 g/袋，启东盖天力药业有限公司），吸入用布地奈德混悬液（药品批号324102，阿斯利康有限公司），卵白蛋白（OVA，美国Sigma公司），IL-3、IL-4、IL-5、IgE、IFN-γ ELISA试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

致敏液：将OVA溶于新鲜配制的10% Al(OH)₃溶液中，充分搅拌混匀，使OVA的终浓度为0.2%。注意混悬液制备后，为保证致敏效果，应于1 h内使用。雾化液配制：将OVA与0.9% NaCl溶液搅拌使其混合均匀，使OVA的终浓度为1%。

1.3 实验分组及哮喘模型的建立

将大鼠随机分为4组，分别为对照组、哮喘模型组、布地奈德组、槐杞黄组，每组10只。通过OVA致敏并激发建立哮喘大鼠模型^[7]。哮喘模型组致敏：第1天采用传统的10点致敏法，包括两前后足趾4点，两侧腹股沟2点，颈部1点，背部左、中、右3点，每点皮下注射0.05 mL OVA致敏液，另腹腔注射0.5 mL OVA致敏液，OVA致敏总体积为每只大鼠1 mL。激发：第14~21天，将小鼠置于密闭容器中并以1%OVA溶液雾化30 min/d。布地奈德组：致敏和激发同哮喘组，从第14天开始，激发前30 min以布地奈德2 mg雾化，每天1次；槐杞黄组：致敏和激发同哮喘组，从第14天开始，激发前1~2 h，以槐杞黄4 g/kg剂量溶于2~3 mL水中，每天灌胃1次。对照组皮下及腹腔注射、雾化、灌胃，哮喘模型组、槐杞黄组激发前雾化，以及哮喘模型组、布地奈德组灌胃均用等量生理盐水替代。

1.4 标本的采集

造模成功后24 h，以10%水合氯醛麻醉大鼠，取外周血。开胸游离出气管和肺，结扎右侧支气管，用0.5 mL生理盐水灌洗大鼠左侧支气管肺泡3次，取支气管肺泡灌洗液（BALF）备用。取左肺及脾脏，-80℃冰箱保存。取小鼠近肺门处的左肺组织，在4%多聚甲醛中固定约4~6 h，进行常规的石蜡包埋及切片，随机选取每个样本3张切片，以行染色检测。

1.5 苏木精-伊红染色

将制备好的切片常规固定、脱水，以进行苏木精-伊红（HE）染色，用来观察气道的病理学改变。

1.6 BALF中嗜酸性粒细胞检测

取各组大鼠BALF，4℃、1 200 r/min离心5 min后，用1 mL Hank′s液重悬细胞，取0.2 mL涂片，瑞吉液染色，至少计数200个细胞作细胞分类计数，依据形态学特点计算嗜酸性粒细胞比例。

1.7 ELISA法检测细胞因子

使用IL-3、IL-4、IL-5、IgE、IFN-γ ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）来测定每组大鼠BALF中细胞因子的浓度。实验步骤按照试剂盒说明书进行操作。根据标准曲线计算各组细胞因子的浓度。

1.8 流式细胞仪检测Th1及Th2细胞比例

分离外周血及脾脏淋巴细胞，加1 mL RPMI1640完全培养基悬浮，每管加入终浓度为20 ng/mL的佛波醇，终浓度为1 μg/mL的钙离子霉素，终浓度为2 μmol/L的莫能菌素，37℃、5%CO₂培养箱孵育4 h；然后加PBS 1 mL，2 000 r/min离心5 min，洗涤2次，PBS 100 μL重悬；加入CD4抗体，4℃避光孵育30 min；2 000 r/min离心3 min，PBS清洗2遍；加入2%多聚甲醛0.5 mL，室温固定20 min；离心，弃上清，加含0.1%皂素的PBS 1 mL，室温孵育10 min；离心，弃上清，加入300 μL PBS重悬，平均分成3管；每管分别加入IFN-γ、IL-4，4℃避光孵育30 min；离心，弃上清，2 000 r/min离心3 min，PBS清洗2遍；每管加入1%多聚甲醛0.1 mL，固定10 min；上机检测。

1.9 RT-PCR检测T-bet mRNA及GATA-3 mRNA水平

取-80℃冰箱中保存的各组大鼠新鲜冰冻肺组织100 mg，匀浆后采用TRIzol试剂裂解10 min，提取总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。提取出的总RNA经逆转录反应体系逆转录成cDNA。10倍稀释cDNA，采用实时荧光定量PCR检测，引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成，序列见表 1。反应体系：cDNA（10×）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix（2×）10 μL，dH₂O 5.2 μL。反应条件：50℃ 2 min，95℃10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。绘制溶解曲线，最终数据以2^-△△Ct法进行分析。

1.10 Western blot检测T-bet及GATA-3蛋白水平

取不同组大鼠肺组织匀浆，细胞裂解液裂解，4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清，BSA法测定蛋白浓度。每组取40 μg蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离、转膜，以5%脱脂牛奶室温封闭1 h，电泳。加一抗过夜，漂洗后加脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应1 h，化学发光底物显色，胶片曝光，扫描。采用的一抗包括兔多克隆抗体T-bet（55 KD）（美国Invitrogen公司，PA5-40573）、兔多克隆抗体GATA-3（50 KD）（武汉三鹰生物技术有限公司，10417-1-AP）、兔多克隆抗体GAPDH（内参）（杭州贤至生物有限公司，AB-P-R 001），所有一抗稀释比例为1 : 1 000；采用的二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司，BA1054），稀释比例为1 : 50 000。所得图像在图像分析系统上分析，结果分别以T-bet、GATA-3与GAPDH的比值进行半定量分析。

1.11 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。不符合正态分布计量资料采用中位数（四分位间距）[M（P₂₅，P₇₅）]表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H非参数检验，组间两两比较采用Nemenyi法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠肺组织切片病理学表现

对照组大鼠肺泡结构正常；哮喘组大鼠肺泡壁结构受损，肺泡壁增厚，支气管腔狭窄，大量黏膜上皮细胞脱落，支气管与血管周围重度炎性细胞浸润；槐杞黄组大鼠肺泡腔较模型组变大，支气管壁水肿程度减轻，炎性细胞浸润程度明显降低，其病理变化程度与布地奈德组相近。见图 1。

2.2 各组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例变化

各组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例比较差异有统计学意义（n=10，F=28.537，P < 0.001）。哮喘组嗜酸性粒细胞比例（0.140±0.023）较对照组（0.016±0.005）显著增高（P < 0.01），槐杞黄组嗜酸性粒细胞比例（0.099±0.022）较哮喘组显著下降（P < 0.01），槐杞黄组与布地奈德组（0.080±0.030）相比差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 各组大鼠BALF中细胞因子水平变化

哮喘组BALF中IL-3、IL-4、IL-5、IgE浓度较对照组显著增加，IL-10、INF-γ浓度较对照组显著下降（P < 0.01）；槐杞黄组IL-3、IL-4、IL-5、IgE浓度较哮喘组显著降低，IL-10、INF-γ浓度较哮喘组显著升高（P < 0.01），但与对照组相比，差异仍有统计学意义（P < 0.05）；槐杞黄组与布地奈德组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

2.4 各组外周血及脾脏Th1、Th2细胞比例变化

哮喘组外周血及脾脏Th1细胞比例较对照组显著降低（P < 0.05），Th2细胞比例较对照组显著增高（P < 0.05）；槐杞黄组外周血及脾脏Th1细胞比例较哮喘组显著增加（P < 0.05），Th2细胞比例较哮喘组显著下降（P < 0.05）；槐杞黄组外周血及脾脏Th1细胞比例与布地奈德组相比差异均无统计学意义（P > 0.05），槐杞黄组外周血Th2细胞比例与布地奈德组比较差异无统计学意义（P > 0.05），但脾脏Th2细胞比例高于布地奈德组（P < 0.05）。见表 3。

2.5 各组T-bet、GATA-3 mRNA及其蛋白表达变化

哮喘组T-bet mRNA及其蛋白表达较对照组显著降低（P < 0.05），GATA-3 mRNA及其蛋白表达较对照组显著增加（P < 0.05）；槐杞黄组及布地奈德组T-bet mRNA及其蛋白表达较哮喘组显著增加（P < 0.05），GATA-3 mRNA及其蛋白表达较哮喘组显著下降（P < 0.05），但与对照组比较差异仍有统计学意义（P < 0.05）；槐杞黄组与布地奈德组比较上述指标差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图 2，表 4。

3 讨论

经典免疫学说认为，Th1/Th2免疫失衡及Th2细胞优势分化是导致哮喘发病的重要机制^[5]。Th1/Th2细胞失衡的同时，Th2细胞相关的细胞因子如IL-3、IL-4、IL-5、IgE等分泌增加，而Th1细胞相关的细胞因子IL-10、INF-γ等分泌减少，启动气道炎症及过敏反应，导致哮喘发作^[8]。槐杞黄是一种真菌类药物，由槐耳菌、枸杞子、黄精等组成，槐耳的主要活性成分是槐耳多糖蛋白，其中由6个单糖结合18种氨基酸组成的结合蛋白，具有免疫调节作用^[9]。临床研究表明，槐杞黄有助于儿童哮喘的治疗^[10-11]，但作用机制未明。

本研究结果显示，哮喘模型大鼠肺组织肺泡壁结构受损，肺泡壁增厚，支气管腔狭窄，黏膜上皮细胞脱落，支气管与血管周围重度炎性细胞浸润；槐杞黄干预后，支气管壁水肿程度减轻，管腔狭窄缓解，炎性细胞浸润程度明显降低，与布地奈德干预后效果相当，表明槐杞黄可显著降低哮喘所致肺泡壁损伤及气道炎症反应。哮喘模型组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例较对照组显著升高，槐杞黄干预后BALF中嗜酸性粒细胞比例较哮喘组明显下降，与布地奈德组比较差异无统计学意义，表明槐杞黄能显著降低气道中嗜酸性粒细胞比例。

细胞因子IL-3、IL-4、IL-5均为Th2细胞产生。IL-4能诱导IgE的产生，抑制Th1细胞活化并分泌细胞因子，与IL-3协同刺激肥大细胞增殖，促进炎症及过敏反应性疾病；IL-5主要功能是刺激嗜酸性粒细胞增殖、分化及活化，同时还促进嗜碱性粒细胞释放组胺和白三烯等炎症介质；IL-10和INF-γ均为Th1细胞因子，可起到下调炎症反应的作用^[5]。本研究结果显示，哮喘组大鼠BALF中IL-3、IL-4、IL-5、IgE浓度显著升高，IL-10、INF-γ浓度明显降低；槐杞黄干预后，IL-3、IL-4、IL-5、IgE浓度下降显著，IL-10、INF-γ浓度明显增高，与布地奈德干预的效果相当，表明槐杞黄能减轻哮喘发作时的炎症反应，减轻哮喘症状。张琴珍等^[12]对槐杞黄在哮喘大鼠中的作用进行研究发现，槐杞黄可以抑制哮喘大鼠血清IgE和IL-5合成，促进INF-γ合成，调节Th1/Th2平衡，发挥其抗嗜酸性粒细胞性气道炎症的作用。

流式细胞仪检测结果更为直观的显示Th1和Th2细胞比例，哮喘组大鼠外周血及脾脏Th1细胞比例下降，Th2细胞比例增加，槐杞黄干预后Th1细胞比例增加，Th2细胞比例下降，与布地奈德干预的效果相当。这一结果与Liang等^[13]进行的小鼠哮喘模型的研究结果相似，表明槐杞黄能纠正哮喘发作时的Th1/Th2免疫失衡，阻断哮喘病理进程。

特异性转录因子T-bet和GATA3是决定Th1、Th2细胞亚群分化方向的关键因素^[6]。T-bet是人类免疫细胞中首次发现的T-box转录因子家族成员，是Th1淋巴细胞特异性转录因子。GATA3是GATA转录因子家族成员，是Th2细胞功能亚群分化的关键调控因子，通过诱导Th2细胞因子的产生，上调Th2细胞分化，还能通过抑制T-bet的表达，抑制Th1细胞信号通路^[13]。本研究结果显示，哮喘组大鼠T-bet表达显著降低，GATA3表达显著上升，使Th1/Th2淋巴细胞比例失衡；而槐杞黄干预后，T-bet表达明显升高，GATA-3表达明显降低，逆转了Th1/Th2失衡，这一作用与布地奈德干预的效果相当，表明槐杞黄通过调节转录因子T-bet和GATA-3的表达，起到纠正哮喘发作时Th1/Th2细胞比例失衡的作用，从而缓解哮喘发作。

综上所述，槐杞黄能明显减轻哮喘大鼠肺泡壁损伤和气道炎症反应，降低嗜酸性粒细胞比例，同时使IL-3、IL-4、IL-5、IgE浓度显著下降，IL-10、INF-γ浓度显著增高，从而纠正Th1/Th2失衡，达到缓解哮喘发作的目的，这一作用是可能通过调节转录因子T-bet、GATA-3来实现的。槐杞黄口服可缓解哮喘病情，效果与吸入糖皮质激素相当，可作为儿童哮喘治疗的推荐方案。