2020, Vol. 22
新生儿败血症是由微生物病原体侵入正常的无菌组织引起的新生儿炎症反应，是导致新生儿死亡的主要原因，在新生儿感染性疾病中居首位[1-2]。足月儿发病率大约为0.1%，但病死率可达20%[3]。
白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）属于CXC趋化因子家族，是前炎症因子之一，主要由单核-巨噬细胞和内皮细胞等产生，感染后诱导中性粒细胞趋化，在炎症反应的发病机制中起着重要作用。在正常情况下IL-8含量很低，而且不受胎龄和出生时间的影响。最近的研究[4-5]表明，遗传因素可能参与了败血症的发展过程，遗传变异可能对宿主免疫、易感性和败血症结局产生影响。许多学者在不同的病理条件下对IL-8的基因多态性与败血症进展的可能性之间的关系进行了研究，推测其与败血症的易感性或保护性有关[6-8]。有研究表明IL-8基因rs4073位点多态性可能导致血清中IL-8浓度增加，从而引起和扩大炎症反应[9]。因此，本课题组采用前瞻性研究方法，选择IL-8基因rs4073位点多态性在新生儿败血症中进行病例对照研究，采用测序技术检测IL-8基因rs4073位点多态性，以探讨IL-8基因多态性与新生儿败血症的易感性及临床相关性，为预测预后提供新的诊断工具。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取2017年1~12月在昆明市儿童医院新生儿科住院的足月新生儿（胎龄≥ 37周且 < 42周），有临床症状、体征，且血培养阳性的50例患儿为败血症组，如血培养结果系条件致病菌，则须在其他部位培养出同种细菌；有临床表现，血培养阴性并具有非特异性检查结果阳性≥ 2项的50例患儿为临床败血症组，诊断标准依照中华医学会儿科学分会新生儿学组2003年提出的《新生儿败血症诊疗方案》 [10]。另选取50例同期住院的非感染足月新生儿为对照组，包括咽下综合征、非感染性腹泻、轻度非溶血性黄疸患儿，产前、产时无感染相关危险因素，无任何临床感染症状，实验室检查相关感染指标无异常。排除标准：（1）合并严重先天畸形（如消化道畸形和先天性心脏病等）；（2）合并遗传代谢性疾病。本研究获得我院伦理委员会的批准（2016-03-012-K01），所有患儿家长均已签署知情同意书。收集各组患儿基本资料，包括胎龄、日龄、性别、出生体重、分娩方式。
1.2 实验室检查及DNA提取各组患儿均在入院时完善血常规、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、降钙素原（PCT）及血培养等实验室检查。用EDTA抗凝管采集静脉血2 mL，-80℃冰箱保存。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit（美国Promega公司），按DNA试剂盒的操作说明提取DNA。分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的DNA将浓度调整到50 ng/μL，转移至384孔板，-20℃储存备用。
1.3 引物设计使用Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计并合成IL-8基因rs4073位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。IL-8 rs4073上游引物：5'-ACGTTGGATGCTGAAGCTCCACAATTTGGT-3'，下游引物：5'-ACGTTGGATGGCCACTCTAGTACTATATCTG-3'；单碱基延伸上游引物：5'-CACAATTTGGTGAATTATCAAA-3'，下游引物：5'-CACAATTTGGTGAATTATCAAT-3'。
1.4 PCR扩增及PCR产物碱性磷酸酶处理PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5 μL：DNA 1 μL、10×buffer 0.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）0.4 μL、dNTPmix（25 mmol/L）0.1 μL、PCR primermix 1 μL、HotStarTaq酶（5 U/μL）0.1 μL，加双蒸水至5 μL。扩增条件：94℃预变性4 min；94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，45个循环；72℃再延伸3 min。将PCR产物用虾碱性磷酸酶（SAP）处理，以去除体系中游离的dNTPs。
1.5 单碱基延伸及树脂纯化在SAP处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积为9 mL：单碱基延伸引物混合物0.9 μL，iPlex bufferplus 0.2 μL，iPlex terminator 0.2 μL，iPlex enzyme 0.04 μL，SAP处理后PCR产物7 μL，加双蒸水至9 μL。反应条件：94 ℃ 30 s；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s，4个循环；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，39个循环；72℃延伸3 min。将延伸产物及水放到已准备好的树脂板中，封膜，离心30 min使树脂沉入孔底部。
1.6 芯片点样启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP（美国Sequenom公司）芯片上。
1.7 质谱检测将点样后的SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱系统（MALDI-TOF）分析，检测结果使用TYPER 4.0软件分型并输出结果。
1.8 统计学分析用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。各组IL-8基因rs4073位点基因型分布采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。符合正态分布计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布计量资料采用中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi法。计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验，若1 ≤理论频数 < 5，使用连续校正卡方检验。应用logistic回归分析IL-8基因多态性（T/A）与新生儿败血症的关系。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 临床资料3组患儿胎龄、日龄、出生体重、性别及分娩方式比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（表 1）。同时对3组新生儿实验室非特异性指标进行比较，败血症组及临床败血症组CRP及PCT水平均高于对照组，败血症组CRP及PCT水平均高于临床败血症组（P < 0.05），WBC及PLT水平在3组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见表 2。
| 表 1 各组患儿临床资料比较 Table 1 2 |
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| 表 2 各组患儿实验室非特异性指标比较 |
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对照组、临床败血症组和败血症组IL-8基因rs4073位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（分别χ2=0.472、0.794、1.158，P>0.05）。IL-8基因rs4073位点各基因型及等位基因频率在3组中的分布比较差异均有统计学意义（P < 0.05），见表 3。
| 表 3 IL-8 rs4073位点基因型及等位基因在各组中的分布情况 |
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将临床败血症组及败血症组患儿合并，以是否患有败血症为因变量，以胎龄、性别、日龄、出生体重、IL-8基因rs4073位点多态性为自变量（自变量赋值见表 4），应用多因素logistic回归分析新生儿败血症的危险因素，结果显示低胎龄是新生儿败血症发病的危险因素（P < 0.05），而性别、日龄、出生体重不是新生儿败血症发病的危险因素（P>0.05）；rs4073位点AA基因型不是新生儿败血症发病的易感基因（P>0.05），而TT基因型可能是新生儿败血症发病的易感基因（P < 0.05）。见表 5。
| 表 4 logistic回归自变量赋值 |
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| 表 5 新生儿败血症危险因素的logistic回归分析结果 |
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新生儿败血症是一种危及生命的疾病，是新生儿发病和死亡的重要原因。识别基因变异可以预测败血症的易感性及结局，这有助于帮助我们识别那些有死亡高风险或严重并发症的患儿，需及时采取积极的治疗。本研究探讨了IL-8基因多态性与新生儿败血症的易感性，结果显示IL-8 rs4073位点基因型AA与新生儿败血症发生风险无明显相关性，而基因型TT可能是新生儿败血症的易感基因。同时，实验室检查非特异性指标hsCRP及PCT升高明显，符合临床败血症诊断的非特异性指标升高条件之一[10]。
IL-8是趋化因子家族的成员之一，其显著特点是中性粒细胞和淋巴细胞的趋化特性，启动和扩大急性炎症反应，以及作为前炎症细胞因子在慢性炎症过程中发挥重要作用[8]。IL-8基因位于4q13-21，含4个外显子、3个内含子和1个近侧启动区[11]。rs4073位点在IL-8的启动子区域，其T/A基因型可影响IL-8启动子区转录活性[12]和IL-8蛋白的表达。不同疾病IL-8基因多态性与各种疾病的易感风险不一。多项研究表明，IL-8基因多态性可能是慢性牙周炎[13]、幽门螺杆菌感染的相关性胃病[14]、细菌性脑膜炎[15]、口腔癌[16]、乳腺癌[17]等的危险因素。Amaya等[12]研究发现纯合子TT基因型的患者表达更高水平的IL-8蛋白。Li等[18]发现IL-8 rs4073位点AA基因型明显增加急性胰腺炎的发病风险。Belopolskaya等[19]认为IL-8 rs4073位点等位基因A可能是脓毒血症的保护基因。Fontes等[15]对西班牙的成人细菌性脑膜炎进行研究发现，IL-8 rs4073位点等位基因T通过减少白细胞的聚集，降低清除病原菌的能力，从而参与了炎症的进程。意大利学者Esposito等[20]对101例血培养阳性和100例有临床症状但血培养阴性的早产儿研究发现，IL-8基因多态性rs4073位点基因型AT和早产儿败血症的严重性相关，通过血液中脂多糖刺激，增加IL-8的产生，启动和扩大炎症过程中发生的反应，也与严重呼吸道感染有关[9]。Hu等[8]对中国人的研究结果显示IL-8基因rs4074位点基因型与成人脓毒血症无相关性，而本研究是针对足月新生儿人群，结果显示IL-8 rs4073位点TT基因型与新生儿败血症的发病有相关性，可能是其易感基因，与Amaya等[12]研究结果相一致。败血症的发病机制复杂，涉及病原菌、环境暴露、宿主的免疫状态及多方面因素的相互作用。同时，不同地域、不同人群、不同种族的基因多态性存在显著差异。
综上，本研究对IL-8基因位点rs4073多态性与足月新生儿败血症的关系进行研究，结果表明，胎龄与新生儿败血症的发生有相关性；出生体重、日龄、性别均不是足月新生儿败血症发生的危险因素，其中出生体重不是新生儿败血症发生的危险因素可能与选择的研究对象均为足月儿有关；IL-8基因rs4073位点基因型TT可能是足月新生儿败血症的易感基因。由于本研究样本量较小，没有对败血症的严重程度分类；其次是未对血清IL-8蛋白水平进行测定，无法了解IL-8蛋白浓度与IL-8 rs4073位点基因型是否存在平行关系。因此需要扩大样本量，对败血症的严重程度进行分类并完善IL-8蛋白浓度测定，对评估新生儿败血症更有临床意义。
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