支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是早产儿常见的呼吸系统疾病，随着医疗水平提高，早期早产儿存活率不断提高，但BPD的发病率也逐渐上升。BPD病死率高，存活者也常遗留不同程度的健康问题，给家庭和社会带来巨大压力^[1]。BPD目前尚无有效治疗方法，以预防为主。故能早期预测BPD发生的生物标志物是近些年来研究的热点，已发现有很多生物标志物与BPD形成相关^[2]。人软骨糖蛋白-39（human cartilage glycoprotein-39, YKL-40）是几丁质蛋白酶家族的成员，具有生长因子及炎症因子特征，参与炎症反应、气道高反应性、气道重塑的过程^[3]；还与微血管的形成密切相关^[4]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1）参与多种炎症性疾病，由被破坏的细胞释放，参与肺损伤的发生发展^[5]；也有研究表明其与组织纤维化密切相关^[6]。很多炎症性疾病中YKL-40、HMGB1表达均增强，在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统炎症性疾病患者的血清中，二者浓度均升高^[7-10]，抑制二者表达可能是这些疾病潜在的治疗方向。炎症是BPD形成的重要机制，二者在BPD患儿血清中的表达也可能发生了变化。为了解二者具体的变化情况，本研究检测了早产儿不同时点血清中YKL-40、HMGB1浓度，通过比较不同时点BPD早产儿及非BPD早产儿血清中YKL-40、HMGB1水平，探讨二者在BPD形成中发挥的作用。

前瞻性选择2017年7月至2019年8月徐州医科大学附属医院新生儿重症监护室（NICU）收治的早产儿为研究对象。纳入标准：（1）出生胎龄≥ 28周且 < 32周；（2）出生体重 < 1 500 g；（3）出生后至第14天均需要呼吸支持；（4）至少存活至生后第28天；（5）排除合并严重感染、先天发育畸形、严重先天性心脏病、先天性肿瘤、遗传代谢性疾病等。

根据《实用新生儿学》第4版中BPD诊断标准：任何氧依赖（浓度>21%）超过28 d的新生儿^[11]。将入选早产儿分为BPD组和非BPD组。

本研究已通过我院医学伦理委员会审核（AF-45/5.1），并征得患儿家长同意并签署知情同意书。

收集患儿出生胎龄、出生体重、Apgar评分、性别及出生方式等资料。于生后第3、7、14天分别采集动脉血1 mL，凝胶促凝管保存，血液凝固20 min内离心20 min（4℃、2 000 r/min、离心半径为10 cm，此步骤在我院检验科完成），待检验科完成生化检查后尽快收集血清于-80℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测量血清YKL-40、HMGB1浓度，试剂盒均购自中国上海将来实业股份有限公司（JL11964、JL13963），严格按照试剂盒说明书进行操作，计算样品浓度。

采用SPSS 21.0对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两样本t检验。两组间不同时点YKL-40、HMGB1浓度比较采用重复测量方差分析，进一步采用Bonferroni法对各时点指标进行两两比较。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P₂₅，P₇₅）]表示，两组间比较采用MannWhitney U秩和检验。计数资料采用例数或百分率（%）表示，组间比较采用χ²检验。Bonferroni法以P < 0.017为差异有统计学意义，余P < 0.05为差异有统计学意义。

共纳入86例早产儿，其中BPD组35例，非BPD组51例。两组患儿的出生胎龄、出生体重、1 min及5 min Apgar评分、性别、出生方式的差异均无统计学意义（P>0.05），见表 1。

表 1 Table 1

表 1 两组早产儿一般资料比较

表 1 两组早产儿一般资料比较 项目 非BPD组(n=51) BPD组(n=35) t/Z/χ2值 P值 性别（男/女，例） 28/23 20/15 0.042 0.837 胎龄(x ± s, 周） 30.6±1.3 30.2±1.4 1.513 0.134 剖宫产[例(%)] 31(61) 18(51) 0.741 0.389 出生体重(x ± s, g) 1 235±168 1 215±156 0.547 0.586 1 min Apgar评分[M(P25, P75)，分] 4(4, 5) 4(3，5) -0.893 0.372 5 min Apgar评分[M(P25, P75)，分] 7(6, 7) 6(5, 7) -1.305 0.192

经重复测量方差分析显示，不同组间YKL-40浓度差异有统计学意义（F=534.042，P < 0.001）；不同时点YKL-40浓度差异有统计学意义（F=114.490，P < 0.001）；时点与组间有交互效应（F=12.982，P < 0.001），提示两组YKL-40浓度随时间变化程度不同。两两比较结果显示，BPD组及非BPD组第7、14天时YKL-40浓度均高于第3天；非BPD组第14天时YKL-40浓度高于第7天（P < 0.017）；BPD组第7天与第14天YKL-40浓度差异无统计学意义（P>0.017）。同一时点两组间血清YKL-40浓度，经两样本t检验结果显示，非BPD组第3、7、14天YKL-40浓度均明显高于BPD组（P < 0.05）。见表 2。

表 2 Table 2

表 2 两组患儿各时点YKL-40水平比较

表 2 两组患儿各时点YKL-40水平比较  （x±s，ng/mL） 组别 例数 第3天 第7天 第14天 非BPD组 51 68±5 73±7a 84±6a, b BPD组 35 50±5 56±7a 59±6a t值 16.978 11.397 20.095 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001   注：重复测量资料方差分析显示了时间因素差异（F=114.490，P < 0.001）；分组因素差异（F=534.042，P < 0.001）；时间因素与分组因素有交互作用（F=12.982，P < 0.001）。a示与同组第3天比较，P < 0.017；b示与同组第7天比较，P < 0.017。

经重复测量方差分析显示，不同组间HMGB1浓度差异有统计学意义（F=204.511，P < 0.001）；不同时点HMGB1浓度差异有统计学意义（F=43.280，P < 0.001）；时点与组间有交互效应（F=14.101，P < 0.001），提示两组HMGB1浓度随时间变化程度不同。两两比较结果显示，BPD组及非BPD组第7、14天时HMGB1浓度均高于第3天；BPD组第14天时HMGB1浓度高于第7天（P < 0.017）；非BPD组第7天与第14天HMGB1浓度差异无统计学意义（P>0.017）。同一时点两组间血清HMGB1浓度，经两样本t检验结果显示，BPD组第3、7、14天HMGB1浓度均明显高于非BPD组（P < 0.05）。见表 3。

表 3 Table 3

表 3 两组患儿各时点HMGB1水平比较

表 3 两组患儿各时点HMGB1水平比较  （x±s，ng/mL） 组别 例数 第3天 第7天 第14天 非BPD组 51 14.1±2.7 17.5±3.6a 16.2±3.0a BPD组 35 19.6±4.2 25.1±5.9a 28.2±6.0a, b t值 7.488 7.390 12.267 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001   注：重复测量资料方差分析显示了时间因素差异（F=43.280，P < 0.001）；分组因素差异（F=204.511，P < 0.001）；时间因素与分组因素有交互作用（F=14.101，P < 0.001）。a示与同组第3天比较，P < 0.017；b示与同组第7天比较，P < 0.017。

BPD是一种以早期肺损伤为主要特征的呼吸系统疾病，表现为肺发育不成熟，肺泡、肺微血管发育障碍和肺组织损伤后异常修复、纤维化^[12]。BPD的发病机制尚未明确，但多种危险因素与其发生密切相关，包括早产和低出生体重、机械通气损伤、炎症反应、遗传因素等^[13]。目前已有多种生物标志物被证实与BPD的形成相关，但大多未得到广泛认可并应用于实际临床工作中。

YKL-40是一种分泌性糖蛋白，属于18糖基水解酶家族，其相对分子质量为40 000，肽链氨基酸起始端包含酪氨酸（Y）、赖氨酸（K）和亮氨酸（L），故命名为YKL-40。YKL-40参与细胞增殖、迁移、分化及组织重塑过程^[14]。本研究中BPD组和非BPD组第7、14天YKL-40水平均较第3天升高，这可能与机械压力作用于气道上皮细胞时，激活上皮细胞生长因子受体信号通路，增强YKL-40表达有关^[15]。YKL-40可以通过MAPK和NF-κB信号通路促进支气管上皮细胞表达IL-8，并促进支气管平滑肌细胞迁移、增殖^[16]，且YKL- 40表达量与平滑肌细胞增生呈正相关^[17]，这也是支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病气道重塑过程的可能机制。支气管平滑肌增生是BPD病理改变之一，YKL-40可能也参与了这一过程，但非BPD组YKL-40水平持续较BPD组高，可能是YKL-40在BPD形成中发挥的作用不仅局限于促进支气管平滑肌增生，也可能是BPD中支气管平滑肌增生并不主要由YKL-40引起。YKL-40也是滑膜成纤维细胞、胎肺成纤维细胞等细胞的生长因子^[18]，与胎肺发育密切相关。早产儿出生时往往伴随肺发育不成熟，本研究纳入对象按胎龄估计肺发育大部分处于小管期或囊泡期^[19]。可能正是由于缺乏YKL-40生长因子作用导致早产儿未成熟的肺发育受到影响，最后导致肺泡数目减少及结构简单化。目前血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）与BPD的相关研究较多，VEGF作为肺微血管生成的生物标志物，可促进肺微血管的形成，其基因多态性与BPD形成密切相关，对BPD形成有一定预测作用^[20]。YKL-40同VEGF一样具有促进微血管形成的作用，同时YKL-40可促使内皮细胞膜上syn-1与整合素αvβ5结合，激活胞内FAK与ERK1/2信号通路，使VEGF表达增强^[21]；也可诱导VEGF受体2表达，增强内皮细胞对VEGF的敏感性^[22]。国内有研究发现第7、14天时BPD早产儿外周血中VEGF水平均明显低于非BPD早产儿^[23]。VEGF的变化趋势与YKL-40相似，提示YKL-40可能通过与VEGF相似方式直接或通过影响VEGF的表达间接参与BPD形成过程，YKL-40也和VEGF一样对BPD形成有一定预测作用。一项国外动物研究发现乳腺退化蛋白39（breast regression protein 39, BRP-39）可抑制高氧所致的小鼠急性肺损伤，而高氧环境也会抑制BRP-39的表达。YKL-40是BRP-39的人类同源物，使用转基因YKL-40可改善高氧所致的小鼠肺损伤。该研究也发现BPD患儿气管吸出液中YKL-40水平较非BPD患儿低^[24]。由此推测，YKL-40也可能通过抑制高氧所致的肺损伤来抑制BPD形成，有可能成为BPD治疗的一个措施。

HMGB1是具有促炎效应的细胞因子，主要存在于细胞核中，可由坏死细胞被动释放，也可由被激活的单核细胞、巨噬细胞主动释放。大量研究表明，HMGB1与急性肺损伤、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等一系列肺部疾病有关，且其表达水平往往与疾病严重程度有关。机械通气可激活肺组织表皮生长因子受体，通过p38 MAPK信号通路诱导HMGB1表达增加^[25]。而HMGB1通过与内源性配体晚期糖基化终末产物和外源性配体Toll样受体相结合，激活活性氧、髓样分化因子88、PI3K通路，最终活化NF-κB，释放IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子，进而引起炎症反应的发生和放大，进一步导致急性肺损伤的发生，HMGB1与炎症反应程度呈正相关^[26]。本研究中BPD组HMGB1水平始终较非BPD组高，可能由BPD组在机械通气刺激下HMGB1过度表达引起。HMGB1持续高表达也加重了炎症反应和肺损伤，使损伤和修复失衡，导致BPD的形成。动物实验显示HMGB1可引起BPD模型小鼠肺泡的弹性蛋白沉积异常，导致肺泡纤维化的形成，而使用HMGB1中和抗体可改善这种情况^[27]。本研究中BPD组HMGB1的长期高表达，可能是BPD纤维化形成的一个原因。HMGB1可能参与了BPD形成中肺损伤及纤维化过程，BPD组HMGB1持续高表达提示HMGB1增高可能也会增加BPD形成风险。抑制HMGB1可成为BPD治疗研究的一个方向，目前发现丙酮酸乙酯可抑制HMGB1的释放从而对肺损伤具有保护作用^[28]，其已通过Ⅰ期临床试验，由此可以展望丙酮酸乙酯及其他HMGB1抑制剂在BPD治疗上的前景。

综上所述，YKL-40虽有炎症因子作用，但其也具有促进微血管生成，促进胎肺成纤维细胞生长，促进肺损伤修复的生长因子作用。BPD组YKL-40表达低下提示YKL-40主要发挥生长因子作用抑制BPD形成。而HMGB1并不像YKL-40一样具有生长因子功能，其主要作为炎症因子参与BPD的肺损伤及纤维化过程，在BPD中表达升高。本研究结果显示在所检测的各个时点，BPD及非BPD组血清中的YKL-40及HMGB1水平均有明显差异，这反映了二者作为BPD预测生物标志物的潜力。BPD组早期YKL-40的持续低表达和HMGB1高表达也提示了通过增加YKL-40及抑制HMGB1以防止BPD形成的可能。然而本研究样本量较小，未在独立人群中验证结果，不能为相应胎龄早产儿提供YKL-40及HMGB1正常值参考范围。且仅测得部分时点YKL-40、HMGB1水平，无法准确反映整个病程中二者的变化情况，有待于更大样本、更长时间的研究深入探讨YKL-40及HMGB1在BPD中的意义。