狼疮性肾炎（lupus nephritis, LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）累及肾脏不同病理类型的免疫损伤，可伴有蛋白尿、血尿、贫血等一系列并发症，约10%~30%的LN患者会发展为终末期肾衰竭，是导致SLE患者死亡的主要原因^[1]。有研究表明，微小核糖核酸（microRNA, miRNA）作为一类高度保守的内源性小分子RNA，通过促进细胞活化、分化、凋亡、代谢及信号传导等机制来调节炎症介质的释放、固有免疫应答、影响Toll样受体等，从而参与调控LN的发生发展^[2-3]。近年来研究发现，miR-145及miR-183与免疫细胞、细胞因子和免疫复合物形成、沉积等免疫异常有关，可能在LN的发病过程中发挥着重要的作用^[4-5]。本研究通过检测LN患儿血浆miR-145及miR-183的表达水平，分析其对儿童LN的诊断价值，旨在为儿童LN的诊断及靶向治疗提供依据。

选取2016年1月1日至2019年5月31日儋州市人民医院收治的LN患儿92例为研究对象，其中男19例，女73例，年龄6~14岁，平均年龄8.3±2.6岁。纳入标准：（1）SLE诊断符合诊断标准^[6]，且LN经肾活检病理证实，尿蛋白≥0.5 g/24 h或+++，或管型；（2）临床资料及病理资料完整，能配合本次研究者。排除标准：合并急性或慢性炎症疾病、急性肾损伤、恶性肿瘤、血液系统疾病，以及严重心、脑、肾等原发性疾病及其他自身免疫性疾病者。另选取40例健康体检儿童作为健康对照组，其中男10例，女30例，年龄7~15岁，平均年龄8.6±2.6岁。本研究经我院伦理委员会批准，伦理审批号：2016-1082，并与患儿家属签署知情同意书。

依据国际肾脏病学会/肾脏病理学会LN分型标准^[7]，将92例LN患儿分为Ⅱ型17例、Ⅲ型15例、Ⅳ型36例、Ⅴ型18例、Ⅵ型6例。采用SLE病情活动指数（Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index, SLEDAI）评分评估疾病活动度，LN稳定组34例（SLEDAI评分 < 10分），LN活动组58例（SLEDAI评分≥10分）。

miR-145引物：正向引物5'-ATGCTCGTCTGC-AGTGTAGT-3'，反向引物5'-GCAGCTAGGCTCGTA-TAC-3'；miR-183引物：正向引物5'-GTCAGCTAG-CTGACTGCTAG-3'，反向引物5'-ATCGACACTGCA-TAGTAG-3'；U6：正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGC-ACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

所有研究对象均抽取空腹静脉血3 mL置于EDTA抗凝管中，离心分离血浆，-80℃低温冰箱保存待测。RNA提取试剂盒购自美国Ambio公司，在ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行实时荧光定量PCR（real time PCR, RT-PCR）检测。miRNA逆转录反应体系（15 μL）：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μL 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸（dNTPs），1 μL逆转录酶（50 U/μL），1.5 μL 10×反转录缓冲液，0.19 μL RNase抑制剂（20 U/μL），4.16 μL无菌三蒸水。反应条件：16℃ 30 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min。以U6为内参，扩增反应体系为20 μL：1 μL引物及探针Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μL反转录产物cDNA，7.67 μL无核酸酶的水。扩增条件为：95℃ 10 min；95℃15 s，60℃ 60 s，45个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定的阈值经历的循环数即为Ct值，采用2^-△△Ct法计算miR-145及miR-183表达水平，其中△Ct=Ct_目的基因-Ct_U6。

采用酶联免疫吸附法检测抗双链DNA（dsDNA）抗体含量，试剂由上海科新生物技术股份有限公司提供；补体C3、补体C4、血清白蛋白（ALB）、C反应蛋白（CRP）、血肌酐（Scr）及血尿素氮（BUN）水平在日立全自动生化分析仪上检测，操作过程均严格按照仪器及配套试剂说明书进行。

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数的比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；两独立样本均数的比较采用成组t检验。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ²检验。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析血浆miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体水平对LN的诊断价值，曲线下面积（area under curve, AUC）的比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

LN组、LN活动组和LN稳定组抗dsDNA抗体、CRP、Scr及BUN水平均明显高于健康对照组（P < 0.05），且LN活动组SLEDAI评分、抗dsDNA抗体、Scr及BUN水平均明显均高于LN稳定组（P < 0.05）。LN组、LN活动组和LN稳定组补体C3、C4及ALB水平均明显低于健康对照组（P < 0.05），且LN活动组ALB水平明显低于LN稳定组（P < 0.05）；而LN活动组和LN稳定组CRP、补体C3及C4水平比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。各组间性别、年龄及体重指数比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

表 1 Table 1

表 1 各组一般资料及实验室指标比较

表 1 各组一般资料及实验室指标比较 组别 n 性别 (男/女, 例) 年龄 (x±s, 岁) 体重指数 (x±s, kg/m2) SLEDAI评分 (x±s, 分) 抗dsDNA抗体 (x±s, IU/mL) 补体C3 (g/L) 补体C4 (g/L) ALB (g/L) CRP (mg/L) Scr (μmol/L) BUN (mmol/L) 健康对照组 40 10/30 8.6±2.6 16.8±2.1 - 34±6 1.14±0.37 0.35±0.12 47±8 3.4±1.1 44±8 2.2±0.8 LN组 92 19/73 8.3±2.6 16.6±2.2 11.7±3.6 274±63a 0.65±0.27a 0.14±0.06a 29±6a 12.2±4.3a 123±21a 11.7±4.4a LN稳定组 34 6/28 8.2±2.6 16.4±2.1 8.2±2.2 248±57a 0.66±0.25a 0.17±0.08a 34±6a 10.6±4.2a 74±13a 8.2±2.6a LN活动组 58 13/45 8.3±2.7 16.8±2.2 14.3±4.6b 307±71a, b 0.62±0.24a 0.13±0.05a 26±5a, b 13.3±5.1a 160±33a, b 14.3±5.2a, b F值 0.324 0.865 0.491 12.418 8.416 6.227 4.116 6.248 3.875 6.937 6.592 P值 0.571 0.370 0.665 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.014 < 0.001 0.020 < 0.001 < 0.001 注：[SLEDAI]系统性红斑狼疮病情活动指数；[dsDNA]双链DNA；[ALB]白蛋白；[CRP]C反应蛋白；[Scr]血肌酐；[BUN]血尿素氮。a示与健康对照组比较，P < 0.01；b示与LN稳定组比较，P < 0.01。

LN组、LN活动组和LN稳定组血浆miR-145及miR-183表达水平均明显低于健康对照组（P < 0.01），且血浆miR-145及miR-183表达水平在LN组和LN活动组均明显低于LN稳定组（P < 0.01），在LN活动组明显低于LN组（P < 0.01），见表 2。

表 2 Table 2

表 2 各组血浆miR-145及miR-183表达水平比较

表 2 各组血浆miR-145及miR-183表达水平比较  （x±s） 组别 n miR-145 miR-183 健康对照组 40 2.95±0.84 1.86±0.43 LN组 92 0.97±0.16a 0.58±0.10a LN稳定组 34 1.51±0.32a, b 0.91±0.20a, b LN活动组 58 0.54±0.06a, b, c 0.34±0.05a, b, c F值 16.348 14.250 P值 < 0.001 < 0.001 注：a示与健康对照组比较，P < 0.01；b示与LN组比较，P < 0.01；c示与LN稳定组比较，P < 0.01。

不同分型LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平均明显低于健康对照组（P < 0.01），且Ⅴ~Ⅵ型组和Ⅳ型组血浆miR-145及miR-183表达水平均明显低于Ⅱ~Ⅲ型组（P < 0.01），见表 3。

表 3 Table 3

表 3 不同分型LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平比较

表 3 不同分型LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平比较  （x±s） 组别 n miR-145 miR-183 健康对照组 40 2.95±0.84 1.86±0.43 Ⅱ~Ⅲ型 32 1.31±0.36a 0.87±0.18a Ⅳ型 36 0.78±0.12a, b 0.45±0.07a, b Ⅴ~Ⅵ型 24 0.70±0.08a, b 0.42±0.05a, b F值 13.852 11.613 P值 < 0.001 < 0.001 注：a示与健康对照组比较，P < 0.01；b示与Ⅱ~Ⅲ型组比较，P < 0.01。

血浆miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体水平诊断LN的最佳截断值分别为1.05、0.62、186.30 IU/mL；三项联合诊断LN的AUC（0.896，95%CI：0.835~0.955）明显高于单项miR-145（0.835，95%CI：0.779~0.895）、miR-183（0.806，95%CI：0.749~0.865）及抗dsDNA抗体（0.780，95%CI：0.722~0.837），差异有统计学意义（分别Z=4.108、4.872、5.216，P < 0.05），其灵敏度和特异度分别为90.5%和84.2%。见表 4和图 1。

表 4 Table 4

表 4 血浆miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体水平对LN的诊断价值

表 4 血浆miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体水平对LN的诊断价值 项目 最佳截断值 AUC(95%CI) 灵敏度 (%) 特异度 (%) 阳性预测值(%) 阴性预测值(%) 阳性似然比 阴性似然比 miR-145 1.05 0.835(0.779~0.895) 84.7 80.3 83.6 81.5 4.299 0.191 miR-183 0.62 0.806(0.749~0.865) 81.5 76.2 79.4 78.3 3.424 0.243 抗dsDNA抗体 186.30 IU/mL 0.780(0.722~0.837) 78.4 74.0 77.3 74.6 3.015 0.292 三项联合 - 0.896(0.835~0.955) 90.5 84.2 88.7 86.4 5.728 0.113

图 1 血浆miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体水平诊断LN的ROC曲线

Pearson相关分析显示，LN患儿血浆miR-145与miR-183表达水平呈正相关（P < 0.05）；血浆miR-145及miR-183表达水平与SLEDAI评分、抗dsDNA抗体、Scr及BUN水平均呈负相关（P < 0.05），与补体C3、补体C4及ALB水平均呈正相关（P < 0.05），与CRP水平均无明显相关性（P > 0.05）。见表 5。

表 5 Table 5

表 5 LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平与实验室指标的相关性分析结果

表 5 LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平与实验室指标的相关性分析结果 项目 miR-145 miR-183 r值 P值 r值 P值 SLEDAI评分 -0.583 < 0.001 -0.524 < 0.001 抗dsDNA抗体 -0.735 < 0.001 -0.696 < 0.001 补体C3 0.408 0.011 0.390 0.025 补体C4 0.337 0.038 0.348 0.032 ALB 0.390 0.031 0.419 0.008 CRP -0.093 0.272 -0.116 0.205 Scr -0.392 0.028 -0.403 0.012 BUN -0.420 0.007 -0.391 0.018 miR-145 - - 0.816 < 0.001

儿童LN是SLE累及肾脏所引起的一种免疫复合物性肾炎，早发现、早诊断及有效治疗是延缓LN进入终末期肾病的有效途径。肾组织活检是LN诊断和判断预后的金标准，但肾组织活检为侵入性操作，不易重复检测。现常用于反映LN疾病活动度的临床检测指标包括红细胞沉降率、CRP、补体C3、补体C4、抗dsDNA抗体等，但这些标志物灵敏度和特异度不高，且其检测结果影响因素较多，尚不能成为评估LN疾病活动度及预后判断的最佳标志物。因此，寻找一种更加灵敏和特异性的生物标志物，对LN的早期诊断和监测疾病进展具有极其重要的临床价值。miRNA是一类长度为18~25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，通过miRNA剪切和抑制蛋白质翻译的方式参与靶基因的转录后调控，在细胞的分化、增殖、凋亡、血管生成及炎症免疫反应中发挥重要作用，参与了LN发生发展过程^[8-9]。有研究表明，miRNA能够通过改变淋巴细胞功能、炎症因子合成释放、改变免疫细胞反应活性或影响核因子κB、Toll样受体等信号通路参与LN发病及病情发展过程^[10]。近期的研究发现，miRNA在LN中异常表达，研究miRNA的表达谱有助于了解LN的发病过程，并可能为LN的早期诊断提供新的发现^[11]。

本研究显示，LN组、LN活动组和LN稳定组SLEDAI评分、抗dsDNA抗体水平均明显高于健康对照组，且LN活动组升高更明显；LN组、LN活动组和LN稳定组血浆miR-145及miR-183表达水平均明显低于健康对照组，且LN活动组血浆miR-145及miR-183表达水平降低更明显。相关分析也显示，LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平与SLEDAI评分均呈负相关。提示血浆miR-145及miR-183表达水平与LN患者疾病活动度有关，是监测LN患者病情的参考指标。Zheng等^[12]研究显示，LN患者miRNA表达水平明显低于健康者，并且患者疾病活动度越高，miRNA表达水平越低，提示miRNA在LN患者的辅助诊断和预后判断中具有一定的临床价值。本研究中不同分型LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平均明显低于健康对照组，且Ⅴ~Ⅵ型组和Ⅳ型组血浆miR-145及miR-183表达水平均明显低于Ⅱ~Ⅲ型组。说明miR-145及miR-183低表达与LN患儿病情严重程度密切相关，Ⅴ~Ⅵ型LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平降低更明显，其可能参与了LN的发生和发展，有望作为判断LN患儿病情恶化的参考指标。刘华等^[13]研究显示，不同病理分型LN患儿的肾血管miR-145表达水平存在明显差异，随着病理分型加重，miR-145表达水平明显降低，miR-145可能参与LN的发病机制并介导肾脏病发展。Zhang等^[14]研究发现，与健康对照组相比，LN患者血浆miRNA表达水平降低，与SLEDAI评分呈负相关，且miRNA表达升高是预测LN发生的独立保护因子，可作为LN诊断的新型标志物。本研究应用ROC曲线分析结果显示，血浆miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体水平诊断LN的最佳截断值分别为1.05、0.62、186.30 IU/mL，三项联合诊断LN的曲线下面积最大，其灵敏度和特异度较好。说明miR-145、miR-183及抗dsDNA抗体三项联合检测有助于提高诊断LN的准确性。相关分析也显示，LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平与抗dsDNA抗体水平呈负相关，这进一步提示三项联合检测对诊断LN具有较高的临床价值。徐兆珍等^[15]研究发现，LN患者抗dsDNA抗体阳性率为63.3%，其对诊断LN及其预后判断、疗效观察等具有重要意义。Cai等^[16]研究认为，miR-145的表达水平随着血管损伤程度的增加而降低，参与了LN的发病过程，其可能作为LN发病及靶向治疗的潜在生物标志物。另有研究表明，miRNA表达水平与疾病发展和疾病严重性有关，在LN患者活动度及预后判断中具有一定的临床价值，同时也为临床治疗LN提供新的思路^[15]。

综上所述，LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平明显降低，且与LN活动度及病理分型相关，联合抗dsDNA抗体检测对LN诊断具有较高的价值，这为临床上准确地诊断和治疗LN提供新的思路和方法。LN患儿血浆miR-145及miR-183表达水平降低，可能是miR-145及miR-183在固有免疫应答的胞内信号转导过程中的负反馈作用，导致其多个靶蛋白的异常积累，促进活化信号的炎症细胞因子释放，参与了LN的发生发展。推测miR-145及miR-183可能通过介导炎症细胞因子的作用，参与了LN的发生发展。但其具体的作用机制尚未明确，今后仍需进一步深入研究。