2020, Vol. 22
2. 东莞市儿童医院科研中心, 广东 东莞 523327;
3. 广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科, 广东 广州 510000
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是髓系造血干/祖细胞恶性疾病，以骨髓和外周血中原始和幼稚髓系细胞异常增生为主要特征。近年来儿童AML的总体生存率可达60%左右，但是难以进一步提高[1]。目前，化疗和造血干细胞移植是AML治疗的常用方法，然而耐药性的出现严重影响其治疗效果，耐药性复发是导致AML患者死亡的最主要原因[2]。因此，深入研究儿童AML的耐药机制具有重要的医学价值。
长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）最早是由Okazaki等[3]在测序过程中发现的一类转录本长度超过200 nt的功能性RNA分子。目前许多研究已证实lncRNAs与白血病的发生、发展、临床表现和预后有密切联系，在靶向分子治疗和预后评价方面具有良好的应用前景[4-6]。lnc RNA linc00467全长711 bp，含有6个外显子。据报道，linc00467在神经母细胞瘤[7]、肺腺癌[8]、肝癌[9]、宫颈癌[10]、结直肠癌[11]等多种肿瘤中发挥作用。本课题组前期通过生物信息学方法，分析TCGA肿瘤数据库中AML患者linc00467的表达水平及预后，发现linc00467高表达的患者其生存期要显著低于linc00467低/中表达的患者。然而，linc00467在白血病中的具体功能作用目前尚未见文献报道。本研究对linc00467在儿童AML中的表达及在增殖与耐药中的作用进行了初步的探索。
1 资料与方法 1.1 研究对象采集2016年5月至2018年6月于广州市妇女儿童医疗中心确诊的5例儿童AML病例的骨髓标本，其中男3例，女2例，年龄4~8岁。本研究已获得广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准（2015012608）及监护人书面知情同意。另采集2018年1~6月在东莞市儿童医院儿童血液科进行骨髓检查提示为正常的3例儿童骨髓标本作为对照，其中男2例，女1例，年龄4~6岁。本研究获得东莞市儿童医院伦理委员会批准及监护人书面知情同意。人AML细胞HL-60购买自中国典型培养物保藏中心细胞库，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，培养于5%CO2、37℃培养箱中。
1.2 主要试剂淋巴细胞分离液购买自北京索莱宝科技有限公司，TRIzol、PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix购买自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，PrimeScriptTM IV 1st strand cDNA Synthesis Mix购买自宝生物工程（大连）有限公司，阿霉素购买自华中海威（北京）基因科技有限公司，CCK-8购自于同仁化学研究所，LipoJetTM转染试剂购买自思科生物科技有限公司。实时荧光定量PCR引物合成自上海生工生物工程有限责任公司，内参GAPDH正向引物：5'-CATCCATGACAACTTTGGTATC-3'，反向引物：5'-CCATCACGCCACAGTTTC-3'；linc00467正向引物：5'-CTGGTTGTTCAGCACCTTCG-3'，反向引物：5'-GGATCGGTGCTGGTTTTGGT-3'。
1.3 骨髓单个核细胞的采集与储存运用淋巴细胞分离液，按照试剂说明书进行，主要操作步骤如下：（1）每个患者常规抽取骨髓液4 mL于肝素抗凝管中。（2）取一空管，加入淋巴细胞分离液3 mL，沿管壁缓慢加入等量骨髓标本，1 500 r/min离心20 min。（3）吸取分离界面层的单个核细胞于1 mL EP管中，加入1 mL 0.84%氯化铵，混匀，静置10 min以充分裂解残余红细胞，1 500 r/min离心5 min。（4）弃上清，加入1 mL生理盐水，将细胞洗涤1次，1 500 r/min离心5 min。（5）重复步骤（4）1次，弃上清，储存于-80℃冰箱中或者直接提取总RNA。
1.4 linc00467表达水平检测采用TRIzol法进行总RNA的提取。采用PrimeScriptTM IV 1st strand cDNA Synthesis Mix进行cDNA合成。实时荧光定量PCR采用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix，在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行。荧光定量PCR反应体系：PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA模板0.3 μL，灭菌去离子水8.5 μL。反应条件：UDG酶激活，50℃ 2 min；95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火/延伸1 min，40个循环。采用2-△△CT法比较基因相对表达量。
1.5 慢病毒介导的基因过表达与基因干扰慢病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2、pMD2.G、PHBLV系列质粒。
1.5.1 基因过表达分为绿色荧光蛋白（GFP）对照组和linc00467过表达组。主要步骤如下：（1）载体构建。linc00467基因序列参见NCBI参考序列NR_026761.2，人工合成linc00467基因序列后插入基因过表达慢病毒载体pHBLV-CMV-MCS-3flag-ZsGreen-T2A PURO的多克隆位点，应用表达GFP的空载体即为GFP对照组。（2）慢病毒包装。按照psPAX2 10 μg、pMD2.G 5 μg、PHBLV系列质粒10 μg、LipoJetTM转染试剂75 μL的体系，在转染前1 d接种于T75瓶培养中的293T细胞。转染6 h后换新鲜培养基。转染72 h后收集病毒上清，置于-80℃备用。（3）病毒感染目的细胞。将30×104 HL-60接种于6孔板，于接种当天加入8 μg/mL Polybrene和100 μL病毒液，感染24 h后换成新鲜正常培养基，感染48 h后添加10 μg/mL嘌呤霉素进行感染阳性细胞的筛选。
1.5.2 基因干扰分为sh-NC对照组和sh-linc00467干扰组。主要步骤如下：（1）载体构建。sh-NC-F：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，sh-NC-R：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；sh-linc00467-F：5'-CAGGGAGGUUUAAUAGACATT-3'，sh-linc00467-R：5'-UGUCUAUUAAACCUCCC-UGTT-3'。将siRNA双链退火后插入pHBLV-U6-ShRNA-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体的多克隆位点。（2）慢病毒包装与病毒感染目的细胞的方法与基因过表达中的方法一致。
1.6 白血病细胞HL-60的增殖实验将3×105个细胞接种于6孔板，置于培养箱内孵育，分别在24、48、72 h后进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。
1.7 白血病细胞HL-60的阿霉素耐药检测将HL-60细胞接种于96孔板，分成6组，每组5个孔，每个孔100 μL培养基，1.5×104个细胞。接种细胞后立即加入阿霉素，阿霉素终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL。24 h后CCK-8检测细胞存活率。
1.8 阿霉素处理细胞后linc00467表达检测将3×105个细胞接种于12孔板，对照组不加药，实验组分别加入终浓度为0.03、0.06、0.12 μg/mL的阿霉素，置于细胞培养箱中培养24 h、48 h后进行总RNA的提取和逆转录，实时荧光定量PCR检测linc00467的表达。
1.9 统计学分析应用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间的比较应用两样本t检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析进行。相关性分析采用Microsoft Excel的CORREL函数。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 linc00467在儿童AML患者中的表达经实时荧光定量PCR检测，本研究中AML患儿的linc00467表达水平（11.7±4.8）明显高于对照组（1.2±0.6）。
2.2 过表达linc00467对白血病细胞耐药性的影响实时荧光定量PCR结果显示linc00467过表达组linc00467相对表达量（5.67±0.34）明显高于GFP对照组（1.07±0.17）（t=-22.379，P < 0.01）。细胞生长曲线显示过表达linc00467对细胞增殖无明显影响（P > 0.05）。细胞耐药性实验结果显示，相比于GFP对照组，linc00467过表达组呈现明显增强的阿霉素耐药性（P < 0.05）。见图 1。
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图 1 过表达linc00467对白血病细胞增殖及阿霉素耐药性的影响 左图为GFP对照组及linc00467过表达组细胞生长曲线，两组不同时间点细胞计数比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。右图为GFP对照组及linc00467过表达组细胞的阿霉素耐药性检测，a示与GFP对照组比较，P < 0.01；b示与GFP对照组比较，P < 0.05。 |
通过慢病毒基因干扰系统在HL-60细胞中干扰linc00467的表达，通过实时荧光定量PCR法检测linc00467的干扰水平，sh-NC对照组linc00467的表达水平为0.98±0.16，明显高于sh-linc00467干扰组（0.19±0.04）（t=10.64，P < 0.01）。细胞生长曲线显示linc00467基因干扰在接种后24 h、72 h检测对细胞增殖无明显影响，在48 h检测到轻微抑制细胞增殖（P < 0.05）。细胞耐药性实验结果显示，相比于sh-NC对照组，linc00467干扰组细胞对阿霉素耐药性明显降低（P < 0.05）。见图 2。
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图 2 干扰linc00467表达对白血病细胞增殖及阿霉素耐药性的影响 左图为sh-NC对照组及sh-linc00467干扰组细胞生长曲线，a示与sh-NC对照组比较，P < 0.05。右图为sh-NC对照组及sh-linc00467干扰组细胞的阿霉素耐药性检测，a示与sh-NC对照组比较，P < 0.01；b示与sh-NC对照组比较，P < 0.05。 |
采用实时荧光定量PCR对阿霉素处理后的HL-60细胞进行linc00467表达的检测，结果表明，与未经阿霉素处理的对照组比较，不同剂量阿霉素处理HL-60细胞不同时间均可显著上调linc00467的表达（P < 0.01），见图 3。
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图 3 阿霉素处理促进linc00467的表达 a示与对照组比较，P < 0.01。 |
常规化疗仍然是治疗AML的主要方法，然而耐药现象的出现严重影响AML的治疗效果，AML耐药问题亟需更多的临床科研工作者去探索。本研究表明lncRNA linc00467在儿童AML中表达上调；本研究还通过基因过表达、基因干扰等技术证实linc00467可增强AML细胞的阿霉素耐药性。此外，本研究进一步发现阿霉素处理能够上调AML细胞linc00467的表达水平，这一正反馈调节可能加速AML患者耐药性的产生。
目前对于linc00467的研究并不多，既往研究提示linc00467与多种肿瘤密切相关，如促进肺癌细胞的增殖与迁移[12-13]，促进肝癌的进展[14-15]，但都限于实体瘤中，鲜有linc00467与白血病的相关报道，本研究揭示了linc00467可能具有促进白血病患者对治疗药物耐药的作用。
linc00467促进白血病细胞对阿霉素耐药的具体分子机制有待于进一步的研究。最近的研究表明，某些lncRNA通过直接与蛋白质结合而发挥其功能作用[16-17]。通过查阅starBase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/）发现，linc00467与RNA结合蛋白IGFBP2、IGFBP3具有潜在的结合能力。而IGFBP2是一种细胞自主性因子，其高表达与AML耐药性相关[18]。因此linc00467可能通过其结合蛋白IGFBP2调控AML细胞耐药，但这一假设尚需进一步的实验证实。本课题组将继续收集儿童AML样本，将这些样本分成初发组、非耐药组及耐药组，比较linc00467在各组样本中的表达差异，并深入研究其耐药机制。
综上，本研究发现了一个在儿童AML中高表达的lncRNA linc00467，linc00467表达水平可能与AML患者预后密切相关。linc00467增强白血病细胞对阿霉素的耐药性，同时，阿霉素可上调白血病细胞linc00467的表达。本研究揭示了AML患者对阿霉素耐药的一种新的机制，为AML的治疗和新药开发提供了依据。
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