Prader-Willi综合征（Prader-Willi syndrome, PWS）是一种由父源染色体15q11-q13区域基因功能缺陷引起的累及全身多系统异常的印记基因遗传病，发病率约1/10 000~1/30 000，其基因缺陷主要类型有父源染色体15q11-q13区域约5~6 Mb片段缺失（60%~75%）、母源单亲二倍体（maternal uniparental disomy, mUPD, 20%~30%）、印记中心缺陷（imprinting center defect, ID, 2%~5%）、染色体易位、重排（＜1%）等^[1]。PWS患儿临床表现复杂多样，缺乏特异性，且受年龄、基因、种族等多种因素影响，仅凭临床诊断标准易造成漏诊、误诊。PWS与新生儿期肌张力低下、喂养困难密切相关，若缺乏早期诊断和干预管理，随年龄增长可逐渐出现严重肥胖、身材矮小、智力障碍和行为异常等问题^[2-3]。二代测序技术通过捕获新合成的末端标记来确定DNA序列，而PWS为甲基化异常所致的表观遗传疾病，其基因组DNA序列无变化，但基因表达和性状可发生遗传变异，因此尚不能通过二代测序技术诊断PWS。目前最主要的检测手段为DNA甲基化分析技术，包括甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增（methylation-specific multiple ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA）和甲基化特异性聚合酶链式反应（methylation-specific polymerase chain reaction, MS-PCR）^[1]。本研究通过对临床疑似PWS患儿进行MS-MLPA技术检测，对确诊PWS患儿依据临床诊断评分标准^[4]进行评估，并分析PWS患儿的围生期特征，以期为进一步完善PWS的临床诊断评分标准及早期诊断提供依据。

1 资料与方法 1.1 研究对象

选择2016年7月至2018年12月在深圳市妇幼保健院出生或儿科就诊，经临床筛查明确为临床疑似PWS患儿94例为研究对象。纳入标准：（1）符合2001年Gunay-Aygun等^[5]提出的不同年龄段PWS进行分子检测的临床筛查标准，即① 年龄＜2岁，低肌张力伴吸吮力差；②2岁≤年龄＜6岁，低肌张力伴吸吮力差、整体发育迟滞；③6岁≤年龄＜13岁，低肌张力伴吸吮力差、整体发育迟滞、过度摄食、肥胖（若不控制饮食）；④年龄≥13岁，有认知受损、精神发育迟缓、过度摄食、肥胖（若不控制饮食）、下丘脑性性腺机能减退，伴或不伴行为障碍。（2）年龄＜18岁。（3）染色体核型正常（新生儿病例在生后2周内染色体核型报告正常）。（4）排除其他明确病因的疾病。

本研究获深圳市妇幼保健院伦理委员会批准，审批号为深妇幼伦审[2017]33号。患儿监护人均签署知情同意书。

1.2 血样采集及DNA提取

获知情同意后，采集所有研究对象的外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用Lab-Aid 824核酸提取试剂盒（厦门致善生物科技股份有限公司提供）提取DNA，DU-800核酸蛋白分析仪（美国Beckman公司）测纯度、浓度，置于-20℃保存。

1.3 MS-MLPA反应

采用含有47个特异性探针的MS-MLPA试剂盒Me028（荷兰MRC-Holland公司）对基因组DNA进行检测，其中11个15q11区域外参考探针，28个针对PWS/天使综合征（AS）特异性探针，5个甲基化特异性探针，3个甲基化质控探针。反应步骤如下：（1）DNA的变性和探针杂交：DNA 3 μL置PCR仪98℃变性10 min，降温至25℃时加入1.5 μL探针混合液（0.75 μL SALSAprobe Mix+ 0.75 μL MLPA缓冲液）于室温下混匀，95℃孵育1 min，60℃杂交16~20 h。（2）连接和酶切反应：PCR仪降至20℃，加入6.5 μL A液（1.5 μL Ligase buffer A+5 μL H₂O）混匀，取5 μL至新管。PCR仪升至49℃，加入5 μL B液（4.125 μL H₂O+0.75 μL Ligase buffer B+0.125 μL Ligase 65）进行拷贝数检测；新管加5 μL含酶B液（3.875 μL H₂O+0.75 μL Ligase buffer B+0.125 μL Ligase 65+0.25 μL HhaI）进行甲基化检测；49℃孵育30 min，98℃加热5 min。（3）扩增：待PCR仪降至4℃，加入5 μL PCR混合物（3.75 μL H₂O+1 μL PCR Primer Mix+ 0.25 μL SALSA Polymerase）混匀后，启动PCR反应，95℃30 s、60℃30 s、72℃ 1 min，33个循环，72℃ 20 min。（4）产物分析：ABI 3130毛细管电泳分离，取9 μL甲酰胺和1 μL PCR反应产物进行毛细管电泳（ABI 3500DX）。（5）数据分析：采用Genemarker软件以正常人检测图谱为对照分析数据。

1.4 临床资料收集

回顾性收集所有研究对象的临床资料，包括母孕史、出生史、生长发育史、体格检查、临床诊断评分结果等。

1.5 PWS的临床诊断评分标准

根据《中国Prader-Willi综合征诊治专家共识（2015）》^[4]中的临床诊断评分标准对PWS患儿进行评分并记录。该评分标准包括6条主要标准和11条次要标准。主要标准（1分/项）有：（1）新生儿和婴儿期肌张力低下、吸吮力差；（2）婴儿期喂养、存活困难；（3）1~6岁间体重过快增加，肥胖、贪食；（4）特征性面容：婴儿期头颅长、窄脸、杏仁眼、小嘴、薄上唇、嘴角向下（3种及以上）；（5）外生殖器小、青春发育延迟，或发育不良、青春期性征发育延迟；（6）发育迟缓、智力障碍。次要标准（0.5分/项）有：（1）胎动减少，婴儿期嗜睡、少动；（2）特征性行为问题：易怒、情感暴发和强迫性行为等；（3）睡眠呼吸暂停；（4）15岁时仍矮小（无家族遗传）；（5）色素沉着减退（与家庭成员相比）；（6）与同身高人相比，小手（＜正常值第25百分位数）和小足（＜正常值第10百分位数）；（7）手窄、双尺骨边缘缺乏弧度；（8）内斜视、近视；（9）唾液黏稠，可在嘴角结痂；（10）语言清晰度异常；（11）自我皮肤损伤（抠、抓、挠等）。年龄＜3岁患儿，总分≥5分（主要诊断标准达4分）；年龄≥3岁，总分≥8分（主要诊断标准达5分）即可诊断^[4]。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，偏态分布计量资料以中位数（范围）表示。计数资料以例和构成比（%）表示。

2 结果 2.1 临床疑似PWS患儿的基本资料

94例临床疑似PWS患儿中，男55例，女39例，中位入组年龄4岁8个月（范围：13 d至14岁5个月），见表 1。

2.2 MS-MLPA检测结果

94例临床疑似PWS患儿中，11例检测到父源拷贝数或甲基化异常，确诊为PWS，检出率为12%。83例未检测到拷贝数或甲基化异常（图 1A），为非PWS儿童。11例确诊病例中，7例（64%）为父源缺失型PWS，包括5例父源缺失I型（图 1B）、2例父源缺失Ⅱ型（图 1C）；4例（36%）存在甲基化异常，可能为mUPD或ID（图 1D）。

2.3 PWS患儿的围生期特征和临床诊断评分结果

11例PWS患儿均为汉族；男7例，女4例；中位确诊年龄3岁4个月（范围：25 d至6岁8个月）；足月儿9例，早产儿2例；平均出生体重为2.6±0.5 kg，平均出生身长为48.3±1.8 cm。患儿均为剖宫产出生，其围生期主要临床特征有：宫内胎动减少9例（82%），新生儿期均有肌张力低下、吸吮力差及哭声低下。其他临床特征及临床诊断评分见表 2。11例中仅5例（46%）达到PWS临床诊断标准^[4]，余6例（54%）未达到，分值相差0.5~2.5分，大多数为3岁以上儿童。见表 2。

3 讨论

PWS于1956年由Prader等^[6]首次报道，是引起综合征性肥胖症的常见原因之一^[3]，其临床表现复杂，存在地域和种族的差异，造成临床诊断较为困难。为此，1993年Holm等^[7]提出了PWS的临床诊断评分标准，2012年Cassidy等^[1]修正了该标准^[1]，2015年中国专家共识参考上述标准，制定了PWS临床诊断评分标准^[4]。Gunay-Aygun等^[5]根据Holm等^[7]的临床诊断评分标准进行评分，发现17%（15/90）PWS患儿不符合该临床诊断标准，继而提出了PWS临床筛查标准。本研究依据Gunay-Aygun等^[5]的筛查标准，筛选出94例疑似病例进行MS-MLPA检测，结果确诊PWS 11例（12%）。Tuysuz等^[8]对65例0~2岁肌张力低下的婴儿进行PWS筛查，11%（7/65）的婴儿确诊为PWS，与本研究检出率基本相符。同时本研究根据我国PWS临床诊断评分标准^[4]对11例PWS患儿进行评分，发现6例（54%）未达到临床诊断标准，分值相差0.5~2.5分。因此，仅根据临床诊断评分有可能造成漏诊、误诊，需进一步完善该临床诊断评分标准。

现阶段国外报道的PWS平均诊断年龄从18 d至4.9岁不等^[9-11]。李洁玲等^[12]研究显示PWS确诊年龄为14 d至14岁，病程最长可达9年。本研究PWS确诊年龄为25 d至6岁8个月，中位年龄3岁4个月。PWS属罕见病，由于临床医师认识不足，或选择不当的早期基因检测方法，往往造成诊断延误^[11]。因此，对早期临床筛查的疑似PWS患儿应尽早行合适的基因检测方法明确诊断，如高分辨染色体核型分析（HRB）、荧光原位杂交术（FISH）、微阵列基因分析（CMA）、DNA甲基化分析等，这些方法都有各自的局限性，应根据实际情况综合运用。HRB、FISH均属细胞遗传学检测方法，两者仅能检出部分的缺失型PWS与染色体易位，HRB缺失型的检出率约60%，FISH将缺失型检出率提升至70%~75%。CMA可检测基因组拷贝数缺失与重复，但不能明确其等位基因来源，确诊PWS仍需联合甲基化分析、FISH等检测手段^[1]。其中DNA甲基化分析技术是目前应用最为广泛的PWS分子生物学诊断手段，包括MS-PCR和MS-MLPA技术，两者均可覆盖 > 99%的PWS^{[1, 4]}。MS-PCR技术不能区分PWS的遗传发病类型，相反，MS-MLPA技术不仅能分辨父源缺失型与非缺失型，同时可区分父源缺失Ⅰ、Ⅱ型，另外MS-MLPA也可检测出AS^[13]。本研究应用MS-MLPA技术确诊PWS患儿11例，包括5例（45%）父源缺失I型、2例（18%）父源缺失II型、4例（36%）甲基化异常。研究表明，不同基因型PWS的某些临床特征在出现频率或严重程度上有所差异^[14]，且不同基因型PWS家庭PWS的再发风险不同，如父源缺失型和mUPD的再发风险＜1%，而印记中心微缺失患儿的再发风险可达50%，存在母亲15号染色体同源罗伯逊易位[t(15q;15q)]患儿的再发风险接近100%^[4]。因此，早期明确基因型对指导PWS患儿治疗及遗传咨询有重要意义^{[1, 4]}。

本研究中PWS患儿中绝大多数为足月儿，出生体重、出生身长多低于正常范围。所有患儿均为剖宫产出生，国内有报道PWS患儿剖宫产率为64.3%~83.3%^[14-16]；Singh等^[17]报道剖宫产率约55%，认为高剖宫产率与宫内窘迫、羊水过多、胎心异常因素相关。本研究中82%患儿产前存在胎动减少，与文献报道的72.7%~90.9%的发生率基本一致^[17-19]。Holm等^[7]和中国专家共识^[4]都将胎动减少作为临床诊断标准的次要证据之一。Gunay-Aygun等^[5]发现胎动减少虽为次要诊断证据，但其敏感性较高（89.3%），提示在产前筛查时应予以关注。Yang等^[20]对134名PWS患儿的围生期特征进行分析，发现主要特征有宫内胎动减少（88.6%）、剖宫产（82.8%）、肌张力低下（98.5%）、喂养困难（99.3%）及哭声低下（97.8%）。本研究中11例PWS患儿均存在新生儿期低肌张力、吸吮困难、哭声低下。多个研究显示肌张力低下、吸吮困难、哭声低下为我国PWS患儿新生儿期普遍存在的临床特征^{[14-16, 18]}，对于存在上述临床特征的患儿，临床医师需警惕PWS的可能性。

典型PWS患儿在新生儿期表现为肌张力低下和喂养困难，需要留置胃管或特殊工具喂养，极大地增加了患儿的住院率和医疗费用^[1]。Shoffstall等^[21]发现所有年龄段PWS患者的住院治疗费用是非PWS患者的4.8~10.7倍，且治疗费用和住院时间随诊断年龄的延误而增加。Bacheré等^[22]发现早期诊断结合多学科护理可缩短PWS婴儿的住院和胃管喂养时间，并可预防早期肥胖。研究显示，早期生长激素治疗不仅能改善身材和身体成分（降低体脂和增加肌肉），还能降低肥胖相关并发症的发生率和病死率^[23]。因此，有国外学者建议对新生儿进行PWS筛查，以降低漏诊、误诊带来的家庭和社会负担^{[11, 24]}。其中Mahmoud等^[24]采用MS-PCR和MS-MLPA在新生儿筛查滤纸血样中成功识别了30例PWS患儿，为实现PWS新生儿筛查提供了一定的依据。

综上所述，对临床疑似PWS患儿，如有宫内胎动减少、剖宫产、新生儿期低肌张力、吸吮困难和哭声低下等，应及早进行基因检测确诊，单纯依靠临床诊断评分可能导致PWS漏诊。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突关系。