中国当代儿科杂志  2020, Vol. 22 Issue (9): 990-995  DOI: 10.7499/j.issn.1008-8830.2003326

引用本文  

陈晓雯, 陈德晖, 吴上志, 等. 抗中性粒细胞胞浆抗体在儿童闭塞性细支气管炎病情评估中的价值[J]. 中国当代儿科杂志, 2020, 22(9): 990-995.
CHEN Xiao-Wen, CHEN De-Hui, WU Shang-Zhi, et al. Value of anti-neutrophil cytoplasmic antibody in assessing the severity of bronchiolitis obliterans in children[J]. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics, 2020, 22(9): 990-995.

基金项目

国家自然科学基金（81770063）；广州市科技创新项目（201504281719217）

作者简介

陈晓雯, 女, 硕士, 医师

通信作者

陈德晖, 女, 教授。Email:cdh84@126.com

文章历史

收稿日期：2020-03-31
接受日期：2020-08-10
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
抗中性粒细胞胞浆抗体在儿童闭塞性细支气管炎病情评估中的价值
陈晓雯1, 陈德晖1, 吴上志1, 谢娜1, 刘文宽2, 林育能1, 张亚文1, 曾庆思3    
1. 广州医科大学附属第一医院儿科, 广东 广州 510120;
2. 广州呼吸健康研究院, 广东 广州 510120;
3. 广州医科大学附属第一医院影像科, 广东 广州 510120
收稿日期：2020-03-31；接受日期：2020-08-10
基金项目：国家自然科学基金（81770063）；广州市科技创新项目（201504281719217）
作者简介：陈晓雯, 女, 硕士, 医师.
通信作者：陈德晖, 女, 教授。Email:cdh84@126.com.
摘要：目的 探讨抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）在儿童闭塞性细支气管炎（BO）病情评估中的临床价值。方法 前瞻性选取2009年6月至2014年10月诊断为BO的患儿59例为研究对象，应用酶联免疫吸附法检测患儿血清中的髓过氧化物酶（MPO）及蛋白酶3（PR3）ANCA的浓度，根据其结果将患儿分为ANCA双阴性组（n=22）、ANCA单阳性组（n=17）及ANCA双阳性组（n=20）。比较入院时各组患儿的BO发生危险因素、临床症状、胸部高分辨CT（HRCT）及肺部病理学评分，以及ANCA表达水平及临床症状、胸部HRCT评分随时间的变化。结果 ANCA双阳性组患儿的BO危险因素评分明显高于ANCA双阴性组（P＜0.05），ANCA单阳性组及双阳性组的临床症状、胸部HRCT及肺部病理学评分均高于ANCA双阴性组（P＜0.05）。患儿出院后随访6个月，MPO-ANCA、PR3-ANCA滴度水平均较入院时和出院时降低（P＜0.05）；其临床症状评分亦低于入院时（P＜0.05），但胸部HRCT评分与入院时比较差异无统计学意义（P＞0.05）；ANCA单阳性组及双阳性组的临床症状评分仍高于ANCA双阴性组（P＜0.05）。结论 ANCA表达水平与BO患儿的病情严重程度具有相关性，对病情评估有一定的临床意义。
关键词：闭塞性细支气管炎    抗中性粒细胞胞浆抗体    儿童    
Value of anti-neutrophil cytoplasmic antibody in assessing the severity of bronchiolitis obliterans in children
CHEN Xiao-Wen1, CHEN De-Hui1, WU Shang-Zhi1, XIE Na1, LIU Wen-Kuan2, LIN Yu-Neng1, ZHANG Ya-Wen1, ZENG Qing-Si3    
Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China
Author: Chen D-H, Email: cdh84@126.com.
Abstract: Objective To study the value of anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) in assessing the severity of bronchiolitis obliterans (BO) in children. Methods A prospective analysis was performed on 59 children who were diagnosed with BO from June 2009 to October 2014. ELISA was used to measure the concentrations of myeloperoxidase (MPO)-ANCA and proteinase 3 (PR3)-ANCA in serum. According to the results of ELISA, the children were divided into three groups:double-negative ANCA (n=22), single-positive ANCA (n=17), and double-positive ANCA (n=20). The three groups were compared in terms of the scores of BO risk factors, clinical symptoms, chest high-resolution computed tomography (HRCT), and lung pathology on admission, as well as the changes in the expression level of ANCA and the scores of clinical symptoms and chest HRCT over time. Results Compared with the double-negative ANCA group, the double-positive ANCA group had a significantly higher score of BO risk factors (P < 0.05), and the single-positive ANCA group and the double-positive ANCA group had significantly higher scores of clinical symptoms, chest HRCT, and lung pathology (P < 0.05). The children were followed up for 6 months after discharge, and there were significant reductions in MPO-ANCA and PR3-ANCA titers from admission and discharge to the end of follow-up (P < 0.05), as well as a significant reduction in the score of clinical symptoms from admission to the end of follow-up (P < 0.05), while there was no significant change in the score of chest HRCT from admission to the end of follow-up (P > 0.05). The single-positive ANCA and double-positive ANCA groups still had a significantly higher score of clinical symptoms than the double-negative ANCA group (P < 0.05). Conclusions The expression level of ANCA is correlated with the severity of BO in children and thus has certain clinical significance in disease evaluation.
Key words: Bronchiolitis obliterans    Anti-neutrophil cytoplasmic antibody    Child    

闭塞性细支气管炎（bronchiolitis obliterans，BO）是一种严重难治、致残致死率极高的慢性肺疾病。儿童BO的发病多与下呼吸道感染相关，被认为是急性呼吸道病毒感染后遗症，其中有1%急性毛细支气管炎患儿可发展为感染后BO[1-2]。BO的临床特征及影像学缺乏特异性，临床上更多依赖于排他性诊断，尚缺乏特异性的诊断指标。抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA）是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体，其靶抗原以髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）和蛋白酶3（proteinase 3, PR3）最为常见[3]。初始对ANCA的研究主要集中于血管炎等风湿免疫性疾病[4-5]，随着研究深入ANCA所涉及的疾病范围不断增加，近来有文献报道ANCA在肺间质性疾病中亦有异常表达[6-7]。目前国内外尚无ANCA与BO相关的研究，本课题组前期研究发现MPO-ANCA与PR3-ANCA在BO患儿中异常表达并持续升高[8]，推测BO患儿中高滴度的ANCA与中性粒细胞的表面抗原结合，使其释放大量氧自由基及蛋白水解酶，损伤小气道上皮细胞，引起上皮细胞局部坏死，最终表现为细支气管管腔缩窄甚至闭塞。为进一步探讨ANCA在BO中的临床意义，本研究对2009年6月至2014年10月在本院儿科住院诊断为BO的患儿进行ANCA血清水平的检测，评估其与患儿BO发生的危险因素、临床症状、胸部影像学及肺组织病理评分的关系，分析ANCA表达水平与BO临床严重程度的相关性。

1 资料与方法 1.1 研究对象

前瞻性选取2009年6月至2014年10月在本院儿科住院诊断为BO的患儿共59例为研究对象。诊断及纳入标准符合参考文献[9]：（1）急性下呼吸道感染或急性肺损伤后6周以上的反复或持续喘息、气促或咳嗽、喘鸣、呼吸困难，对支气管扩张剂无反应；（2）临床表现与胸部X线显示的轻重不符，临床症状重，胸部X线显示多为过度通气；（3）胸部CT显示马赛克灌注征、支气管壁增厚、支气管扩张、肺不张；（4）肺功能示阻塞性通气功能障碍；（5）排除其他引起喘息的阻塞性疾病，如支气管哮喘、原发性纤毛运动障碍、囊性纤维性变、异物吸入、先天发育异常、肺结核、艾滋病和其他免疫功能缺陷病等。尚需同时满足以下条件：（1）经规范吸入糖皮质激素治疗3个月无效；（2）经支气管镜行肺组织穿刺活检，排除支气管异物、呼吸道发育畸形、哮喘、自身免疫性疾病等。该研究已获得医院伦理委员会批准（医伦审2014第33号）及患儿家属知情同意。

1.2 血清ANCA的检测及分组

所有研究对象均在入院第1天、出院时及出院6个月后采集静脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min，离心后取上层血清，使用ELISA试剂盒（美国宙斯公司）对血清样本进行MPO-ANCA、PR3-ANCA检测，操作过程严格按照试剂说明书进行。根据校正品的平均OD450值即可算出样品的MPO-ANCA、PR3-ANCA抗体浓度，计算公式为：待测样品浓度=（待测样品OD值×变异系数）/校正品平均OD值；阳性判定值为≥180 AAU/mL。根据两种抗体的阳性结果将患儿分为ANCA双阴性组（MPO-ANCA、PR3-ANCA均为阴性）、ANCA单阳性组（MPO-ANCA、PR3-ANCA其中1种为阳性，另1种为阴性）、ANCA双阳性组（MPO-ANCA、PR3-ANCA均为阳性）。

1.3 评估BO发生的危险因素

Murtagh等[10]研究发现导致BO发生的危险因素有：住院超过30 d、机械辅助通气、重症肺炎、高碳酸血症、合并麻疹病毒感染、神经系统症状、凝血功能障碍，参考其研究结果，根据是否存在上述危险因素分别给予每项0分（无）或1分（有），得分越高提示存在发生BO的危险因素越多。

1.4 评估临床症状严重程度

参考婴幼儿喘息性疾病的Lowell评分[11]中喘息严重程度评分法、小儿危重病例评分法[12]、《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[13]中呼吸困难严重程度评分法、《咳嗽的诊断与治疗指南（2009版）》[14]中咳嗽积分表，将BO患儿常见的临床特点按表 1中的4个等级进行量化，总分值越大提示临床症状越重。

表 1 临床症状严重程度评分表
1.5 评估胸部影像学表现

所有患儿胸部高分辨CT（high-resolution CT, HRCT）均采用Siemens 128层螺旋CT或Toshiba 16层螺旋CT扫描，自肺尖至肺底行连续扫描。参考Moonnumakal等[15]及Konen等[16]对BO患儿胸部HRCT的研究，将患儿HRCT征象量化评分为：马赛克灌注征（1分）；马赛克灌注征+细支气管管壁增厚/合并支气管扩张/肺实变不张（2分）；马赛克灌注征+细支气管壁增厚+合并支气管扩张/肺实变不张（3分）。

1.6 评估肺组织病理学表现

参考Mauad等[17]对BO患儿肺组织病理学的研究，将患儿经支气管肺活组织检查（transbronchial lung biopsy, TBLB）结果量化评分为：上皮损伤脱落坏死（1分）；基底膜纤维化增生（2分）；基底膜纤维化增生，合并免疫组化MM8（+）、MMP9（+）、TGF-β1（+）或细支气管狭窄闭塞（3分）。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本或配对样本的t检验。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，多个独立样本的比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi法；多个相关样本的比较采用Friedman M检验，组间两两比较采用q检验；配对样本比较采用Wilcoxon符号秩检验。计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用四格表资料卡方检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 BO患儿入院时的临床资料

59例患儿入院时均进行ANCA血清水平检测，其中双阴性22例、单阳性17例、双阳性20例。3组患儿性别、年龄、病程及住院时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。ANCA双阳性组患儿的BO危险因素评分明显高于ANCA双阴性组（P＜0.05），但ANCA单阳性组与双阴性组及双阳性组之间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。ANCA单阳性组及双阳性组患儿的临床症状、HRCT及肺组织病理学评分均明显高于ANCA双阴性组（P＜0.05），但ANCA单阳性组与双阳性组之间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

表 2 BO患儿入院时的临床资料
2.2 BO患儿ANCA表达水平及临床症状、胸部影像学的变化

对本研究中59例BO患儿进行出院6个月后随访观察，其中2例死亡，8例失访，获得完整随访资料共49例纳入以下研究，其中ANCA双阴性17例、ANCA单阳性15例、ANCA双阳性17例。

患儿出院时与入院时MPO-ANCA与PR3-ANCA的滴度水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而出院后6个月则均较入院时明显降低（P＜0.05）。患儿MPO-ANCA及PR3-ANCA阳性率分别在入院时、出院时及出院后6个月比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。

表 3 不同时间BO患儿ANCA水平比较（n=49）

BO患儿的临床症状评分在出院后6个月较入院时降低（P＜0.05），BO患儿入院时、出院后6个月HRCT评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表 4）。ANCA双阴性组、单阳性组及双阳性组临床症状评分分别为20.0（18.0，20.5）、23.0（21.0，23.0）、23.0（21.0，24.0）分（H=24.39，P＜0.05），ANCA单阳性组和双阳性组临床症状评分均高于双阴性组（分别χ2=14.19、21.32，P＜0.05），而ANCA单阳性组与双阳性组之间比较差异则无统计学意义（χ2=0.50，P=0.78）。

表 4 不同时间BO患儿临床症状及影像学评分比较（n=49）
3 讨论

随着儿童重症医学及器官移植技术的发展，儿童BO发病率逐渐增加，成为国内外学者关注的焦点。本课题组前期研究资料治疗显示73% BO患儿为重症肺炎后发展而成，15%需要机械通气。儿童BO因反复肺部感染，持续气促及低氧血症，逐渐进展为肺纤维化而需反复住院治疗。然而，BO患儿的临床特征及影像学缺乏特异性，难以获得早期诊断，大部分患儿常因细支气管管腔弥漫性狭窄甚至闭塞出现进行性低氧血症、严重阻塞性通气功能障碍，甚至出现难以逆转的呼吸功能衰竭时，才引起临床上的关注，最终错失了早期干预的最佳时机。

ANCA作为一种自身抗体，初始的研究主要集中于ANCA相关性血管炎（AAV），其滴度水平与疾病活动性呈正相关，被视为AAV诊断及病情监测的生物标记物[19-20]。本课题组前期研究发现MPO-ANCA与PR3-ANCA在BO患儿中均异常表达并持续升高[8]，推测BO与AAV可能有相似的机体免疫异常反应基础。为进一步明确ANCA与BO发病的关系，本课题组继续进行深入的临床研究。目前诊断BO仍是临床-影像-病理的诊断模式，尚缺乏评估病情的量化指标，本研究参考多位学者的研究结果设定了BO发生的危险因素、临床症状、胸部影像学及肺组织病理学评分。通过比较不同ANCA表达水平的BO患儿的评分情况，我们发现与ANCA阴性者相比，ANCA阳性者BO发生的危险因素、临床症状、胸部影像学及肺组织病理学的评分值均更高。这提示，ANCA阳性患儿存在更多危险因素，胸部HRCT表现为马赛克灌注征合并细支气管管壁增厚、支气管扩张的概率更高，病理学出现基底膜纤维化增生及细支气管狭窄也更为常见，由此推测ANCA表达水平与BO的临床严重程度密切相关。

为探讨ANCA在BO患儿病程中的变化趋势，本研究在患儿入院时、出院时及出院后6个月分别进行ANCA血清浓度检测，结果显示患儿出院时ANCA水平未有明显变化，而出院后6个月MPO-ANCA与PR3-ANCA的滴度水平均较入院时明显降低。对此我们推测，由于BO患儿小气道阻塞，反复的炎症和感染相互作用使中性粒细胞长期定植，其胞膜表面表达的MPO、PR3抗原可持续诱导刺激ANCA的产生，加之ANCA属于IgG抗体，而血清中IgG维持时间长、消失慢，故短期的抗炎治疗难以降低ANCA的水平，需经长时间治疗后组织才得以修复，ANCA水平逐渐下降。在出院后6个月随访中，我们发现患儿临床症状评分较入院时明显下降，而ANCA阳性者的评分仍高于ANCA阴性者，提示经长期治疗，BO患儿的临床症状逐步改善，而ANCA表达水平与患儿病情变化相吻合。患儿出院后6个月胸部HRCT评分无明显变化，可能与患儿细支气管不同程度的慢性炎症损伤及进行性纤维化改变贯穿于整个疾病过程，闭塞的细支气管无法逆转有关。不过由于儿童处于生长期，支气管及肺组织将随年龄增长而逐渐发育，气道阻力相对减少，胸部影像学可能需要更长的时间才会呈现出变化，因此临床上对BO患儿病情的评估需要综合多方面因素考量。

综上所述，ANCA的表达水平与BO患儿病情严重程度具有相关性，对于患儿的病情监测有一定的临床意义，其中ANCA在BO发病中的作用机制及是否可以作为BO诊治的生物标记物有待进一步的研究。

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