脐血(umbilical cord blood, UCB)富含造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC)，在临床应用中，已证明移植输注的有核细胞总数(total nucleated cell, TNC)和CD34⁺细胞数量是快速植入和延长生存期的主要预测指标^[1]，且与中性粒细胞恢复明显相关^[2]。因此，UCB库倾向于选择TNC和CD34⁺细胞数量较高的UCB，具体数值规定因脐血库而异。但单份UCB中TNC和CD34⁺细胞数量有限，更适用于治疗低出生体重儿^[3]。本研究通过分析除胎龄外其他围生期因素与UCB中TNC、CD34⁺细胞计数的关系，作为UCB库合理选择UCB的参考。

1 资料与方法 1.1 研究对象

本研究纳入2019年6月至2020年1月大连市妇女儿童医疗中心产科无先天性疾病的健康孕妇，经孕妇或家属知情同意后，采集其分娩新生儿的UCB用作科学研究。排除娩出的死亡/畸形新生儿。

1.2 一般资料收集

采用医院信息采集系统调查和收集围生期的相关信息，内容主要包括：孕母年龄、孕母血型(A/B/AB/O型)、妊娠糖尿病(GDM)(无/有)、妊娠高血压(PIH)(无/有)、受孕方式(自然妊娠/辅助生殖)、分娩方式(顺产/剖宫产)、单胎/双胎，新生儿体重、性别、生后Apgar评分(正常/异常)，以及胎盘(正常/异常)、羊水胎粪污染(无/有)、脐带绕颈或身体其他部位(无/有)。所获得的调查资料双份录入自行创建的Excel表格。

孕期疾病包括GDM、PIH，由我院产科医师于妊娠期间诊断，GDM诊断标准参考第9版《妇产科学》^[4]及《妊娠合并糖尿病诊治指南(2014)》^[5]，PIH诊断标准参考第9版《妇产科学》^[4]及《妊娠期高血压疾病：国际妊娠期高血压研究学会分类、诊断和管理指南(2018)》解读^[6]。羊水胎粪污染、脐带绕颈、Apgar评分在胎儿分娩后由我院产科及新生儿科医师共同评估。

1.3 UCB采集

在大连市妇女儿童医疗中心产房或手术室收集新生儿UCB 130份(2~3 mL/份)。新生儿断脐后10 s内行UCB采集：选择距离胎盘断端约5~8 cm，用碘伏消毒两遍，消毒范围4~5 cm，穿刺针头斜面朝下或侧面小角度刺入，见血后沿血管壁顺行1~2 cm，采UCB 2~3 mL，止血钳夹闭穿刺点上端血管，取下针头，边采边混匀，填写标本信息，4℃冰箱暂时存放，并于24 h内检测。

本课题获得产妇及家属知情同意，并经大连市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准(2019015)。

1.4 TNC计数

采用XN-350全自动血液分析仪计数UCB标本中的TNC。

1.5 流式细胞仪检测CD34⁺细胞占TNC比例

根据细胞计数计算UCB所需标本量(加入细胞数约2×10⁶个)，样品管中加入10 μL CD45 PercP和20 μL CD34PE，震荡，混匀，室温避光孵育20 min，加1~3 mL裂解液，震荡混匀，避光裂解10 min。以1 500 r/min离心5 min，弃上清。各管加3~5滴PBS重悬，标记细胞用CantoII流式细胞仪上机检测。通过质控品检测保证仪器运行状态正常。应用Diva软件进行数据分析，取CD45弱阳、CD34阳性、前向角散射较淋巴细胞大的细胞占CD45⁺细胞的比例，为CD34⁺细胞占TNC比例。

1.6 计算CD34⁺细胞数量

CD34⁺细胞数量=TNC×CD34⁺细胞占TNC比例。

1.7 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用成组t检验；非正态分布计量资料采用中位数(四分位数间距)[M(P₂₅，P₇₅)]表示，组间比较采用U检验或Kruskal-Wallis H检验。Pearson相关性分析描述两个连续变量之间的相关性。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般资料

采集到的130例UCB标本中，早产儿57例(42.5%)，足月儿73例(57.5%)；单胎118例(90.8%)，双胎12例(9.2%)；顺产116例(89.2%)，剖宫产14例(10.8%)；自然妊娠112例(86.2%)，辅助生殖18例(13.8%)；男65例，女65例，男女比例为1 : 1；早产儿的平均出生体重为(2 488±560)g，足月儿平均出生体重为(3 354±395)g，其中包括5个极低出生体重儿(< 1 500 g)。

2.2 母婴因素对UCB中TNC及CD34⁺ HSPC的影响

孕母情况：孕母平均年龄为(30±4)岁，相关性分析提示孕母年龄与UCB中TNC无明显相关性(r=0.132，P=0.134)，与CD34⁺细胞计数呈正相关(r=0.262，P=0.003)。本研究纳入130例新生儿母亲的血型均为Rh阳性，A型36例(27.7%)，B型37例(28.5%)，AB型15例(11.5%)，O型42例(32.3%)，不同孕母血型的UCB中TNC、CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

妊娠期疾病：37例(28.5%)孕母患有GDM，有无GDM孕母的UCB中TNC、CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。GDM孕母分娩新生儿体重为(2 973±699)g，无GDM孕母分娩新生儿体重为(2 975±619)g，两组间比较差异无统计学意义(t=0.018，P=0.986)。16例(12.3%)孕母患有PIH，有无PIH孕母的UCB中TNC及CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

受孕方式及分娩方式：受孕方式中，112例(86.2%)为自然妊娠，18例(13.8%)为辅助生殖；分娩方式中，116例(89.2%)为顺产，14例(10.8%)为剖宫产。不同受孕方式及分娩方式下，UCB中TNC、CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

单胎/双胎：12例(9.4%)新生儿为6对异卵双胞胎，无同卵双胞胎标本，无三胎及以上新生儿UCB，单胎与双胎UCB中，TNC、CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

新生儿情况：男65例(50.0%)，女65例(50.0%)，不同性别新生儿的UCB中TNC、CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。新生儿平均出生体重为(2 974±640)g，出生体重与TNC、CD34⁺细胞计数无明显相关性(分别r=-0.113，P=0.201；r=-0.159，P=0.070)。126例(96.9%)新生儿生后Apgar评分正常(8~10分)，其中117例(90.0%)生后1、5、10 min Apgar评分均为10分，4例Apgar评分(3.1%)异常，Apgar评分正常及异常新生儿UCB中TNC及CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

其他：130例UCB标本中，102例(78.5%)胎盘形态正常，28例(21.5%)胎盘形态异常(如球拍状胎盘、副胎盘等)，胎盘正常与异常组间UCB的TNC、CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。53例(40.8%)有脐带绕颈或身体其他部位，有无脐带绕颈或身体其他部位组间UCB的TNC及CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。5例(3.8%)有羊水胎粪污染情况，有无胎粪污染组间UCB的TNC及CD34⁺细胞计数比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 1。

3 讨论

自1988年Gluckman等^[7]对一名范科尼贫血患儿首次成功进行UCB移植以来，UCB移植治愈了数百例血液系统恶性肿瘤或影响造血系统的遗传疾病^[8]。与其他来源相比，UCB具有许多优势：病毒污染的发生率少；可快速获得、长期保存；移植物抗宿主发生率较低，患者生存质量高；免疫原性较弱，可耐受非血缘HLA1-2/6个位点不合的移植等^[9-11]。

本文采集母婴因素并分析各因素对UCB中TNC、CD34⁺细胞计数的影响，以优化UCB献血者的选择。迄今为止，产妇年龄对UCB HSPC的影响争议比较大。Bielec-Berek等^[12](n=50)研究结果证明产妇年龄与CD34⁺细胞计数无明显相关性。另外有报告产妇年龄是HSPC浓度的影响因素^[13]。本研究提示孕母年龄与UCB的CD34⁺细胞计数呈正相关。分析原因为：本研究中孕母年龄分布在21~40岁，大多数(93.8%)分布在25岁以上，而女性25岁以后皮肤及身体各项机能开始慢慢变老，体内会产生过多的自由基，从而导致造血细胞增加。

孕期疾病：有研究发现GDM不是影响UCB中TNC的因素^[14]，Hadarits等^[15]证明GDM产妇UCB中CD34⁺细胞含量较多，Kong等^[16]报道GDM母亲的UCB胶质干细胞的分化潜能、氧化应激能力降低。本研究发现患GDM产妇的UCB中TNC及CD34⁺细胞计数与未患GDM相当，与Hadarits等^[15]的研究存在差异，可能与本研究纳入的GDM产妇饮食及运动血糖控制良好有关。有研究^[17-18](n=5 713)提示患有PIH不会影响UCB中TNC及CD34⁺细胞计数，而Nordin等^[19](n=70)及Ahmed等^[20](n=50)研究发现先兆子痫组的造血干细胞中CD34⁺细胞计数低于对照组。本研究结果为患PIH母亲的UCB中TNC及CD34⁺细胞计数与未患PIH相当。

目前关于分娩方式对UCB影响的研究较多，但结果不尽相同。有研究发现阴道分娩UCB质量优于剖宫产^[21]，另有研究证明剖宫产UCB中CD34⁺细胞数量较阴道分娩高^[22]，而一些研究发现分娩方式不影响CD34⁺细胞的含量^[23-25]。这些差异可能与种族、民族及地域相关^[26]。本研究提示顺产与剖宫产的UCB中TNC及CD34⁺细胞计数比较差异无统计学意义；此外，本研究发现受孕方式、双胎、产妇血型、胎盘形态、羊水胎粪污染均不影响UCB中HSPC数量，与早期结果一致^[27]。

有研究提示新生儿体重与UCB中TNC、CD34⁺细胞计数无相关性^[28]，而Nguyen等^[29]发现呈正相关。本研究提示新生儿体重与UCB中TNC、CD34⁺细胞计数无相关性。大多数研究表明新生儿性别不影响UCB质量^[29-30]，但Bijou等^[31]在校正出生体重后发现男性新生儿UCB中CD34⁺细胞含量较高。本研究结果为不同性别新生儿的UCB中TNC及CD34⁺细胞计数无差异，因此新生儿性别对UCB中CD34⁺细胞计数不产生影响。Mazzoccoli等^[24](n=17 936)研究提示新生儿Apgar评分与UCB质量呈负相关，可能与Apgar评分异常增加新生儿呼吸窘迫发生率^[32]有关。本研究提示Apgar评分不影响CD34⁺细胞数量，可能与本研究中大多数(96.9%)Apgar评分正常有关。

Al-Sweedan等^[27](n=200)发现脐带绕颈新生儿UCB中CD34⁺细胞计数增加。本研究发现脐带绕颈不影响TNC及CD34⁺计数，分析原因可能与本研究中53例脐带绕颈新生儿，大多数为绕颈1周，较少引起脐带压迫及UCB动力学改变有关。

当然，本研究仍然存在一些不足：(1)除课题研究的因素外，仍存在许多影响因素，例如孕母烟酒史、产次、分娩时间等均对胚胎发育有影响。(2)新生儿生后Apgar评分、脐带绕颈两个因素，因样本分布不均、组间样本差异较大等原因，可能存在统计学误差。

本课题发现孕母年龄在25~40岁时，UCB中CD34⁺细胞数量随孕母年龄增大而增多。故脐血库在选择UCB前，可以根据孕母年龄进行权衡和选择，旨在：(1)避免UCB的CD34⁺细胞消耗；(2)增加TNC。而其余所研究围生期因素均不影响UCB中CD34⁺细胞数量，因此，脐血库在筛选UCB干细胞供者时，本研究结果可为扩大UCB干细胞的采集范围提供参考。