2021, Vol. 23
婴儿胆汁淤积症是婴儿期最常见的肝胆疾病，国外文献报道发病率约1/5 000~1/2 500[1]，其病因复杂，如诊治不及时，会严重影响患儿生长发育，甚至导致死亡。而部分肝内胆汁淤积症临床表现不典型，常规检查无特异性，临床诊断困难。近年来随着基因检测技术的发展和临床应用，越来越多不明原因的婴儿胆汁淤积症得以明确诊断，国外研究表明基因检测对婴儿肝内胆汁淤积症的诊断有重要价值[2-4]，国内尚缺少相关的研究报道。本研究总结疑似遗传代谢性婴儿肝内胆汁淤积症患儿的临床资料，并用目标基因捕获结合高通量测序技术对患儿进行基因检测，分析基因检测结果阳性患儿的临床表现及基因型特点，明确基因检测在婴儿肝内胆汁淤积症诊断及遗传咨询中的作用，提高临床医师对本病的认识，为本病的早期诊断提供经验。现总结如下。
1 资料与方法 1.1 研究对象分析2017年6月至2019年6月于首都儿科研究所附属儿童医院消化内科就诊的疑似遗传代谢性婴儿肝内胆汁淤积症患儿的临床资料。纳入标准：（1）根据北美儿科学会推荐，当总胆红素（TBIL） < 85 μmol/L时，结合胆红素（DBIL） > 17 μmol/L；当TBIL > 85 μmol/L时，DBIL所占比例 > 20%[5]。（2）起病年龄小于1岁。（3）入组患儿均行代谢性肝病相关基因检测。（4）排除存在胆道闭锁等肝外胆管病变的患儿。
本研究已获得患儿父母知情同意，并通过本院医学伦理委员会批准（SHERLL2020014）。
1.2 临床资料收集临床资料采集主要包括（1）患儿性别、起病年龄、就诊年龄、出生史、静脉营养史，大便颜色情况等；（2）实验室检查结果：血生化、病原学检查等；（3）腹部超声等。
1.3 基因检测经患儿监护人同意后，抽取患儿及其父母外周血，提取基因组DNA，制备全基因组文库并进行质控。应用GenCap液相捕获目标基因技术，捕获代谢性肝病相关基因的编码外显子区域，对捕获到的区域进行双端测序。对测序深度、均一性、探针特异性等数据进行统计分析。用GATK软件对各个样本的比对数据进行多态性位点的检测，对单核苷酸多态性、插入突变、缺失突变等数据进行分析，参考美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）序列变异解读标准和指南对变异位点进行致病性综合评估[6]。根据需要测序的DNA片段合成引物，用聚合酶链反应（PCR）法进行扩增，以Sanger法进行验证。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行数据处理。计数资料以例和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。计量资料以中位数（四分位数间距）[M（Q1，Q3）]表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 临床资料共纳入40例患儿，其中男24例（60%），女16例（40%）；中位起病年龄为0.1（0.1，1.0）个月，中位就诊年龄为2（2，3）个月；足月儿27例（68%），早产儿13例（32%）。40例（100%）患儿均有黄疸；7例（18%）出现白陶土色便；7例（18%）巨细胞病毒（CMV）DNA阳性；13例（32%）发现致病基因。基因阳性组与基因阴性组丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆汁酸（TBA）、TBIL及DBIL差异无统计学意义（P > 0.05），见表 1。
| 表 1 基因阳性组与基因阴性组临床资料比较 |
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13例患儿中，男6例，女7例，均有皮肤黄染；病例4新生儿期因早产、低体重应用静脉营养史大于2周；病例6存在心脏畸形；病例13新生儿期有肠梗阻，且大便为白陶土样；2例患儿CMV-DNA阳性。13例患儿中，包括3例SLC25A13基因突变导致的希特林蛋白缺乏症，3例JAG1基因突变导致的Alagille综合征，3例ABCB11基因突变导致的进行性家族性肝内胆汁淤积症2型，1例HSD3B7基因突变导致的先天性胆汁酸合成障碍1型，1例AKR1D1基因突变导致的先天性胆汁酸合成障碍2型，1例NPC1基因突变导致的尼曼匹克病，1例CFTR基因突变导致的囊性纤维化。见表 2。
| 表 2 13例基因阳性患儿的临床特点及基因结果 |
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病例1检测出SLC25A13基因存在复合杂合突变。c.852_855del(p.R284fs)，为移码突变，该变异为零效变异，可能导致基因功能丧失，符合PVS1；在千人数据库（http://www.internationalgenome.org/home）、ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org）、ESP6500数据库（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；HGMD数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk）已有该位点的致病性报道，符合PS1。c.615+5G > A(splicing)，为剪接突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；在HGMD数据库中已有该位点的致病性报道，符合PS1。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿父亲及母亲。故该复合杂合变异判定为致病性变异。见表 2。
病例2检测出SLC25A13基因存在复合杂合突变。c.736delG(p.D246Mfs*3)，为移码突变，该变异为零效变异，可能导致基因功能丧失，符合PVS1；正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2。IVS16ins3kb，为插入突变，在HGMD数据库中该变异为已知的致病性变异，符合PS1。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿父亲及母亲。故该复合杂合变异判定为致病性变异。见表 2。
病例3检测出SLC25A13基因存在复合杂合突变，c.1095delT(p.F365Lfs*43)，为移码突变；该变异为零效变异，可能导致基因功能丧失，符合PVS1；正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；HGMD数据库已有该位点的致病性报道，符合PS1。c.1064G > A(p.R355Q)，为错义突变，HGMD数据库已有该位点的致病性报道，符合PS1；多种生物信息学蛋白功能预测软件均为有害，符合PP3。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿母亲及父亲。故该复合杂合变异判定为致病性变异。见表 2。
病例4检测出JAG1基因存在c.3521C > T(p.P1174L)杂合错义突变，在正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件均为有害，符合PP3。经家系验证分析，患儿母亲该位点存在杂合变异，患儿父亲该位点无变异。该变异临床意义未明，结合患儿临床，考虑该变异可能致病。见表 2。
病例5检测出JAG1基因存在c.2906T > C(p.M969T)杂合错义突变，在正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；HGMD数据库已有该位点的致病性报道，符合PS1。经家系验证分析，患儿母亲该位点存在杂合变异，患儿父亲该位点无变异。该变异判定为可能致病性变异。见表 2。
病例6检测出JAG1基因存在c.439+1G > A(splicing) 杂合剪接突变，在正常对照人群中未见该变异，符合PM2；HGMD数据库已有该位点的致病性报道，符合PS1。经家系验证分析，患儿父母该位点均无变异，为自发突变。故判定该变异为致病性变异。见表 2。
病例7检测出ABCB11基因有复合杂合突变。c.3334G > T(p.W1112F)，为错义突变，该变异位点位于AAA+_ATPase_domain|ABC_transporter-like|P-loop_containing_nucleoside_triphosphate_hydrolase功能域，符合PM1；正常对照人群中未见该变异，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。c.908+1G > A(splicing)，为剪接突变，该变异为零效变异，可能导致基因功能丧失，符合PVS1；在正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；HGMD数据库已有该位点相关报道，符合PS1。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿母亲及父亲。故该复合杂合变异判定为致病性变异。见表 2。
病例8检测出ABCB11基因存在2个突变。（1）c.2594C > T(p.A865V)，为纯合错义突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3；经家系验证分析，患儿父母均存在该位点杂合变异；故判定该变异为可能致病性变异。（2）c.667C > T(p.R223C)，为杂合错义突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3；经家系验证分析，患儿父亲该位点存在杂合变异，患儿母亲该位点无变异；故判定该变异为临床意义未明。综合分析该基因变异为可能致病性变异。见表 2。
病例9检测出ABCB11基因存在复合杂合突变。c.2594C > T(p.A865V)，为错义突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。c.239T > C(p.L80P)，为错义突变。正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿母亲及父亲。故判定该复合杂合变异为可能致病性变异。见表 2。
病例10检测出 HSD3B7基因存在复合杂合突变。c.557C > T(p.T186M)，为错义突变，在正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。c.968C > G(p.T323R)，为错义突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿母亲及父亲。判定该复合杂合变异为可能致病性变异。见表 2。
病例11检测出 AKR1D1基因存在复合杂合突变。c.158A > G(p.D53G)，为错义突变，在正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3；HGMD数据库已有该位点相关报道，符合PS1。c.658A > C(p.S220R)，为错义突变，在正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿母亲及父亲。故判定该复合杂合变异为可能致病性变异。见表 2。
病例12检测出NPC1基因存在复合杂合突变。c.2328delT(p.T777Pfs*4)，为移码突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；多种生物信息学蛋白功能预测软件为有害，符合PP3。c.2230_2231del(p.V744Sfs*27)，为移码突变，正常对照人群中该变异频率极低，符合PM2；HGMD数据库已有该位点相关报道，符合PS1。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿父亲及母亲。故判定该复合杂合变异为致病性变异。见表 2。
病例13检测出CFTR基因存在复合杂合突变。c.317_324del(p.I106fs)，为移码突变，该变异为零效变异，可能导致基因功能丧失，符合PVS1；正常对照人群中未见该变异，符合PM2；HGMD数据库已有该位点的致病性报道，符合PS1。c.1456G > T(p.G486X)，为无义突变，该变异为零效变异，可能导致基因功能丧失，符合PVS1；正常对照人群中未见该变异，符合PM2；HGMD数据库已有该位点的致病性报道，符合PS1。经家系验证分析，上述变异分别来自患儿母亲及父亲；故判定该复合杂合变异为致病性变异。见表 2。
3 讨论婴儿肝内胆汁淤积症病因复杂，早期诊断、早期治疗可改善患儿预后。近年来，高通量测序技术因其速度快、通量高等特点广泛应用于临床，在分子生物学研究及疾病诊断方面发挥巨大作用。Togawa等[2]应用二代测序技术对肝内胆汁淤积症婴儿进行基因检测，28%患儿明确基因诊断。本研究共纳入40例疑似遗传代谢性婴儿肝内胆汁淤积症患儿，经二代基因测序发现13例（32%）患儿存在致病基因。13例基因阳性患儿中1例生后外周静脉营养应用史大于2周，2例CMV-DNA阳性，因此临床上对存在长期应用静脉营养史、CMV感染患儿不能忽略遗传代谢性肝病。
本研究中，3例患儿明确为SLC25A13基因突变导致的希特林蛋白缺乏症。希特林蛋白缺乏症是由SLC25A13基因突变引起的常染色体隐性遗传病，该基因突变可导致位于肝细胞线粒体内膜的Citrin蛋白即天冬氨酸/谷氨酸载体2型蛋白功能缺陷，从而导致各种代谢紊乱[7]。本病临床主要表现为肝内胆汁淤积性黄疸、肝功能异常、低血糖、凝血功能异常、高甲胎蛋白血症、多种氨基酸异常等[8]。本病在东亚国家发病率较高，不同种族之间SLC25A13基因突变存在明显的遗传异质性[9-10]。迄今为止，已报道106种SLC25A13基因突变位点，多为点突变、插入突变、缺失突变[11]。中国患儿常见的突变为851del4和1638ins23突变。本研究中3例希特林蛋白缺乏症患儿均为复合杂合突变，发现了6种基因突变类型，其中c.736delG在HGMD数据库中未见报道。
本研究中3例患儿考虑为JAG1基因突变导致的Alagille综合征。该病为常染色体显性遗传病，与JAG1及NOTCH2基因变异有关[12]，可有胆汁淤积、心脏杂音、角膜后胚胎环、蝶状椎骨、特征性面容等多系统受累的表现，典型肝脏病理表现为小叶间胆管缺乏。经典诊断标准需满足3种以上主要临床表现，而研究报道[13]存在JAG1基因突变的患儿可仅有1~2个器官损害，因此基因检测技术对本病的诊断有重要意义。本研究中3例患儿存在JAG1基因突变，1例患儿突变类型为c.439+1G > A剪接突变，该突变为自发突变，且患儿存在心脏畸形；另2例患儿未见典型心脏畸形等表现，考虑与本病不全外显特征有关[14-15]。
本研究中3例患儿存在ABCB11基因突变，考虑为进行性家族性肝内胆汁淤积症2型。进行性家族性肝内胆汁淤积症为婴儿期或儿童期起病的常染色体隐性遗传性疾病，根据致病基因不同分为6型。临床特征为持续性肝内胆汁淤积伴瘙痒，可伴有生长发育障碍，除进行性家族性肝内胆汁淤积症3型（ABCB4基因缺陷）GGT升高外，其余类型GGT不高[16]。文献报道高ALT和高甲胎蛋白、胆结石及肝细胞癌、早期进展为肝衰竭等预示进行性家族性肝内胆汁淤积症2型可能性大[17]。本研究中2例患儿GGT无明显升高，ALT均10倍以上升高伴甲胎蛋白升高。
以低GGT为特征的另一种遗传代谢性胆汁淤积性肝病为先天性胆汁酸合成障碍，其发生与胆汁酸代谢过程中酶基因缺陷有关，多为常染色体隐性遗传，临床罕见。本研究中2例分别为HSD3B7基因突变导致的3β-羟基-C27-类固醇脱氢酶缺陷及AKR1D1基因突变导致的Δ4-3-氧固醇-5β-还原酶缺陷，临床分别确诊为先天性胆汁酸合成障碍1型及2型。2例均为复合杂合突变，突变类型均为错义突变。2例患儿均为婴儿早期出现黄疸，生化检查示GGT正常，胆汁酸水平无明显升高。因初级胆汁酸不仅可抑制毒性代谢产物生成，还可促进肝脏清除内源性胆汁酸及毒物排出，对胆汁酸合成障碍患儿建议给予初级胆汁酸治疗[18]。
本研究发现1例NPC1基因突变导致的尼曼匹克病C型患儿，本病为临床罕见的常染色体隐性遗传性神经内脏脂质沉积病。本例患儿新生儿期出现严重黄疸，体格检查发现脾脏明显增大，骨髓涂片可见泡沫细胞，基因检测发现患儿存在NPC1基因复合杂合突变，均为移码突变, 其中c.2328delT突变为新发现的突变类型。另本研究发现1例CFTR基因突变导致的囊性纤维化患儿，本病为常染色体隐性遗传，亚洲人罕见，临床表现多样，可表现为胰腺分泌功能障碍及纤维化、肝硬化、新生儿胎粪性肠梗阻、复发性呼吸道感染等[19]。以婴儿胆汁淤积为主要表现的囊性纤维化临床罕见，有报道其与胆道闭锁难以鉴别[20]。本患儿生后发生肠梗阻，生后1月余出现黄疸，大便为白陶土样，影像学提示胆囊充盈及收缩功能欠佳，临床表现与胆道闭锁相似，因此对有肠梗阻病史胆汁淤积患儿需警惕囊性纤维化可能。
本研究通过基因型与临床表型的相关性研究进一步形成较为明确的遗传性胆汁淤积患儿的基因Panel，为后续的临床工作明确方向，减少患儿家庭的经济负担。婴儿肝内胆汁淤积症病因繁多，临床表现多样，需积极寻找引起婴儿胆汁淤积症的真正病因，避免漏诊。
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