2021, Vol. 23
2. 郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院呼吸科, 河南郑州 450000
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一种介于细菌和病毒之间的病原微生物，也是儿童社区获得性肺炎最常见的病原体之一，可引起各种临床症状，甚至危及患儿生命安全[1]。儿童肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）大约占社区获得性肺炎的10%~30%，近年来，MPP发病率呈现逐渐上升趋势[2-3]。目前，大环内酯类药物是治疗儿童MPP的首选治疗药物，一直以来均取得了良好效果，但随着大环内酯类药物在临床上的广泛应用，其耐药现象越来越严重，且难治性肺炎支原体肺炎（refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）病例越来越多[4]。MP对大环内酯类药物耐药的分子机制为红霉素的作用靶位23SrRNA Ⅴ区中心环2063及2064位点突变[5]。基于MP仅有1个rRNA操纵子，通常认为23SrRNA Ⅴ区中心环2063及2064位点突变与大环内酯类药物耐药有关[6]。但有关RMPP患儿支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中MP耐药基因情况的报道缺乏大样本量研究。本研究拟分析245例RMPP患儿BALF中MP耐药性及耐药基因分布情况，以期为临床用药提供参考。
1 资料与方法 1.1 一般资料回顾性分析2016年3月至2020年12月郑州大学附属儿童医院收治的RMPP患儿245例为研究对象，其中男133例，女112例，年龄4~13岁，平均年龄（5.2±1.2）岁。纳入标准：（1）符合《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015年版）》[7]中有关MPP诊断标准：①有急性发热、咳嗽等呼吸道感染症状；②胸部影像学检查显示肺部病灶；③血清MP抗体滴度≥1∶160，或血清MP IgM阴性但1周内转阳，或MP DNA检测结果阳性。（2）符合RMPP诊断标准，即使用大环内酯类抗生素进行规范治疗7 d以上，其临床症状及胸部影像学仍然持续加重。排除标准：（1）合并呼吸道合胞病毒、腺病毒及流感病毒等7种常见呼吸道病毒混合感染患儿；（2）排除重症MPP患儿；（3）存在肺部基础疾病患儿；（4）肺结核或既往支气管哮喘患儿。标本采集取得患儿监护人同意，同时本研究经医院医学伦理委员会审批及通过（2021-K-037）。
1.2 BALF采集严格按照《儿科支气管镜术指南（2009年版）》[8]标准和操作规范执行。术前禁食禁水，患儿进入支气管镜检查室，选择平卧位，使用呋麻滴鼻液滴鼻，并使用咪达唑仑针剂镇静，再取合适量的丁卡因胶浆涂抹支气管镜管。使用电子支气管镜（型号：BF-IT290，日本Olympus公司）经患儿一侧鼻孔进镜，注入利多卡因麻醉，同时逐步进镜，直至到达病变部位，使用0.9%氯化钠溶液进行支气管肺泡灌洗（患儿体重≤20 kg时，每次灌洗量为1 mL/kg；患儿体重 > 20 kg时，每次灌洗量为2 mL/kg），灌洗3次，灌洗液总量≤10 mL/kg，立即将无菌痰液收集器连接至支气管镜操作孔道，并以100~150 mm Hg负压抽吸以获取BALF标本。肺泡灌洗后回收率 > 40%、无大气道分泌物混入及红细胞 < 20%为合格标本。将留取的BALF标本分装成2份，1份送病原学检测，1份送耐药基因检测。
1.3 MP DNA检测采用Real-Time PCR法检测MP DNA，试剂盒购买自中山大学达安基因股份有限公司，以MP DNA > 1.0×104 copies/mL为阳性。选取阳性标本用作下一步耐药基因检测。
1.4 MP耐药基因检测（1）提取BALF标本和MP标准株中MP DNA。（2）检测23SrRNA基因位点突变，PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸5 min；取PCR扩增产物10 μL与6×上样缓冲液1 μL混合，采用2%琼脂糖凝胶进行电泳，并拍照和记录结果；引物序列为：F：5'-ACTATAACGGTCCTAAGGTA-3'，R：5'-ACCTATTCTCTACATGATAA-3'，片段大小为244 bp，引物由上海英骏生物技术有限公司设计和生产。（3）DNA测序：将23SrRNA基因PCR扩增产物标本及MP标准株PCR扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将所得测序结果与MP标准株23SrRNA基因序列进行比对，从而确定23SrRNA基因位点基因型。
1.5 统计学方法应用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计数资料以构成比或率（%）表示，组间比较进行检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 RMPP患儿支气管镜下表现及MP DNA检测结果245例行支气管镜检查的RMPP患儿中，镜下全表现为充血水肿（100%），纵行皱襞82例（33.5%），结节突起54例（22.0%），黏膜糜烂、坏死44例（18.0%），痰栓及支气管树样管型或黏稠物40例（16.3%），支气管炎性狭窄25例（10.2%），管腔变形8例（3.3%），支气管闭塞3例（1.2%）。245份BALF标本中，MP DNA检测阳性207例，阳性率为84.5%（207/245）。
2.2 RMPP患儿对不同抗菌药物的耐药性药敏试验结果显示，RMPP患儿对大环内酯类抗菌药物耐药率均较高（> 70%），耐药率由高到低依次为克拉霉素、罗红霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素及阿奇霉素；对喹诺酮类抗菌药物耐药率均较低（< 5%）。见表 1。
| 表 1 207例MP DNA检测阳性RMPP患儿对不同抗菌药物的耐药性分析[例（%）] |
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PCR扩增产物电泳后经凝胶成像系统分析结果显示，阳性BALF标本和MP标准株在244 bp处出现条带，阴性对照未出现特异性条带，23SrRNA Ⅴ区PCR扩增产物基因片段大小为244 bp，如图 1。
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图 1 23SrRNA V区PCR扩增产物电泳图 M为marker，1为阴性对照，2~12为阳性BALF标本，13为MP标准株。 |
207例MP DNA检测阳性RMPP患儿BALF标本基因测序结果显示，41例（19.8%）无耐药基因突变，166例（80.2%）存在耐药基因突变，其中154例（74.4%）突变位点为23SrRNA Ⅴ区中心环2063位A→G点突变，7例（3.4%）突变位点为2064位A→G点突变，5例（2.4%）为2063和2064双位点突变。166例MP 23SrRNA基因点突变中2063位点突变率达95.8%（159/166）。见图 2~3。
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图 2 MP标准株基因测序图 无点突变。 |
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图 3 23SrRNA Ⅴ区中心环2063位A→G点突变基因测序图 箭头所示为突变位点。 |
23SrRNA Ⅴ区中心环2063位A→G点突变对大环内酯类抗菌药物耐药性影响较大，克拉霉素、罗红霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素及阿奇霉素耐药病例的2063位等位基因分布比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星的耐药病例2063位等位基因分布比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
| 表 2 23SrRNA Ⅴ区中心环2063位等位基因与抗菌药物耐药性的关系[例（%）] |
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大环内酯类药物因其不良反应小、使用方便已成为治疗儿童MPP的一线治疗药物[9]。但自2000年以来，世界范围内抗大环内酯类MP逐渐流行[10]。有研究发现，大环内酯类药物耐药现象日趋严重，在我国尤为突出[11]。姜越等[12]报道指出，2011年北京地区儿童MP感染率较高，且对大环内酯类抗菌药物耐药现象严重。Ma等[13]通过分析深圳市儿童大环内酯类耐药MP发现，大环内酯类药物对大环内酯类耐药MP患儿的疗效差于大环内酯类敏感MP患儿。本研究药敏试验结果显示，RMPP患儿对大环内酯类抗菌药物耐药率均较高（> 70%），耐药率由高到低依次为克拉霉素、罗红霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素及阿奇霉素，对喹诺酮类抗菌药物耐药率均较低（< 5%）。提示MP对大环内酯类药物均具有较高的耐药率，而对喹诺酮类抗菌药物较敏感，但也出现少数耐药，可能与喹诺酮类抗菌药物在MPP患儿中使用增加有关。喹诺酮类抗菌药物耐药机制为，药物与MP作用靶点为DNA促旋酶及拓扑异构酶Ⅳ，而编码这两种酶的任一基因发生突变均可能会导致耐药。另外，儿童处于生长发育的阶段，喹诺酮类药物可对其软骨和关节造成损伤，提示临床上针对MPP患儿需要谨慎使用喹诺酮类抗菌药物。
MP对大环内酯类药物耐药机制的研究重点为基因突变。大环内酯类药物通过与核糖体50S亚基23SrRNA结构域V区结合，从而抑制蛋白质合成[14]。有研究表明，MP对大环内酯类药物耐药机制为核糖体50S亚基23SrRNA结构域Ⅴ区及Ⅱ区核苷酸序列变化，从而降低其与核糖体的亲和力，最终导致耐药[4]。另有研究证实，核糖体蛋白中23SrRNA结构域Ⅱ、Ⅴ、L4和L22的突变与其他物种的大环内酯类药物抗性有关[15]。本研究结果显示，207例MP DNA检测阳性标本中，41例（19.8%）无耐药基因突变，166例（80.2%）存在耐药基因突变，其中154例（74.4%）突变位点为23SrRNA Ⅴ区中心环2063位A→G点突变，7例（3.4%）突变位点为2064位A→G点突变，5例（2.4%）为2063和2064双位点突变，提示23SrRNA V区中心环2063、2064位点突变是MP对大环内酯类抗菌药物耐药的分子基础。本研究尚未发现L4和L22突变，与姚慧生等[16]报道相符。具体而言，大环内酯类耐药MP在23SrRNA结构域Ⅴ区存在1个点突变，该突变主要发生在序列的2063和2064位点，且以2063位A→G点突变最为常见，2063位A→G点突变主要引起14和15元环高度耐药，而2064位A→G点突变主要引起16元环高度耐药。另外，大环内酯类药物的主动外排系统和药物灭活作用也可能是导致出现MP耐药的重要原因。本研究结果还显示，166例MP 23SrRNA基因点突变中高达159例存在2063位点突变，突变率为95.8%。郑玥等[17]报道发现，> 60%的大环内酯类抗菌药物耐药患儿可检测到2063位A→G点突变，检测RMPP患儿耐药基因对其早期诊断具有重要意义。Yuan等[18]通过分析120例住院MPP患儿临床特点和耐药性，结果发现，近90%的耐药菌株在23S rRNA基因2063位出现A→G突变。此外，23SrRNA Ⅴ区中心环2063位A→G点突变对大环内酯类抗菌药物耐药影响较大，克拉霉素、罗红霉素、克林霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素及阿奇霉素耐药病例的2063位等位基因分布比较，差异均具有统计学意义，提示大环内酯类抗菌药物耐药与23SrRNA位A→G点突变密切相关。而左氧氟沙星、司帕沙星、加替沙星耐药病例的2063位等位基因分布比较，差异均无统计学意义，提示喹诺酮类抗菌药物耐药可能与23SrRNA位点突变并无相关性。故RMPP患儿BALF中MP对大环内酯类抗菌药物耐药率较高，对喹诺酮类抗菌药物敏感，提示临床需重视RMPP患儿的耐药监测，合理选择抗菌药物，以减少耐药菌株的产生。但本研究仍存在不足，仅涉及常见的2063和2064位点，而对于耐药菌株是否存在其他位点突变及其耐药机制有待深入探讨。此外，本研究缺乏以普通MP肺炎患儿作为对照，无法深入反映耐药基因在RMPP发病中的作用，后续有待进一步研究。
综上所述，RMPP患儿BALF中MP对大环内酯类抗菌药物耐药率较高，23SrRNA V区中心环2063位点突变可能影响MP的耐药机制，临床需及时监测RMPP患儿的耐药情况，并合理选择抗菌药物，以减少耐药菌株的产生，从而为MP治疗提供科学根据。
利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
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