过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura, HSP）是儿童期最常发生的全身性小血管炎，四季均可发病，临床表现为非血小板减少性可触性皮肤紫癜，伴或不伴腹痛、胃肠出血、关节痛等症状^[1-2]，甚至出现肾脏损害，严重影响患儿生活质量及身心健康。HSP患儿体内存在一系列免疫紊乱，其中包括T细胞异常以及细胞因子网络失调，深入探索HSP的免疫发病机制，对诊疗具有重要意义，也是临床迫切的需求。

1986年，Brenner等^[3]在应用T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）的γ基因序列编码制备抗体的过程中首次发现并报道了γδ T细胞。在人体内，αβ T细胞可识别由主要组织相容性复合体分子提呈的蛋白质抗原，是介导细胞免疫及免疫调节的主要细胞，而γδ T细胞是不同于αβ T细胞的一类特殊淋巴细胞，在外周血T细胞中仅少量存在（约0.5%~5%）^[4]，通过因子释放、抗原呈递和直接细胞毒性作用发挥其主要功能，在调节免疫应答、自身免疫性疾病中均有重要作用^[5-6]，其主要表型为CD3⁺CD4^-CD8^-，仅少数为CD4⁺或CD8⁺单阳性细胞。目前有关γδ T细胞与HSP免疫发病机制的研究国内外尚无相关文献报道。本研究通过检测HSP儿童外周血中γδ T细胞及其细胞亚群表达变化、细胞凋亡率和白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）表达水平，以探讨该细胞在HSP免疫微环境中的作用。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选择2018年6~11月宁夏医科大学总医院儿科确诊的14岁以内且院外未使用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗的33例HSP患儿为HSP组，其中男15例，女18例，此次发病年龄7±3岁。HSP诊断标准符合2013年中华医学会儿科学分会免疫学组修订的《儿童过敏性紫癜循证诊治建议》^[2]，即可触性皮疹（必要条件）伴以下任何一条：（1）弥漫性腹痛；（2）任何部位活检示IgA沉积；（3）关节炎或关节痛；（4）肾脏受损表现（血尿和/或蛋白尿）。附：对于典型皮疹急性发作的患儿排除相关疾病可以临床诊断，对于皮疹不典型或未见急性期发作性皮疹者，仍需严格按标准诊断，必要时行皮肤活检。

另选取同期在我院进行体检的21例健康儿童为健康对照组，男11例，女10例，入组年龄9±3岁。HSP组与健康对照组性别（χ²=0.379，P=0.538）及年龄（t=0.379，P=0.151）差异无统计学意义。

本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（2019-207），所有研究对象监护人均知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

鼠抗人多甲藻黄素叶绿素蛋白（PerCP）-Cy™5.5-CD3、鼠抗人别藻青蛋白（APC）-γδ TCR、鼠抗人藻红蛋白（PE）-Vδ2 TCR（美国Becton Dickinson公司）；鼠抗人异硫氰酸荧光素（FITC）- Vδ1 TCR（德国Miltenyi Biotec公司）；FITC-膜联蛋白（Annexin）V/碘化丙啶（PI）双染细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；人IL-17 ELISA试剂盒（美国Abbkine公司）；人外周血淋巴细胞分离液、红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）。FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 标本采集

入院当日或次日清晨空腹状态下抽取外周静脉血5 mL于EDTA抗凝管，Ficoll（ρ=1.077）密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）和血浆后放置-80℃冰箱保存备用。

1.4 流式细胞术检测PBMCs中淋巴细胞、γδ T、Vδ1⁺ T、Vδ2⁺ T细胞比例

磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤PBMCs，调整细胞浓度为2×10⁷/mL，取细胞悬液100 μL，分别加入抗CD3-PerCP-Cy™5.5 20 μL、抗γδ TCR-APC 5 μL、抗Vδ1 TCR-FITC 2 μL、抗Vδ2 TCR-PE 5 μL，对照管加相应的同型荧光标记的单克隆抗体，常温避光下静置20 min；PBS洗涤细胞2次（1 800 r/min，5 min），弃上清；加1%PBS甲醛固定液固定细胞。1 h内用流式细胞分析仪测定γδ T细胞及其细胞亚群的表达。

1.5 γδ T细胞的凋亡检测

取上述已调整细胞浓度的PBMCs 100 μL，加入抗γδ TCR-APC 5 μL，常温避光下静置20 min，PBS洗涤细胞2次（1 800 r/min，5 min），弃上清；对携带APC标记抗体的PBMCs进行FITC-Annexin V/PI双染色。1 h内用流式细胞分析仪测定γδ T细胞的凋亡率。

1.6 ELISA法检测IL-17水平

ELISA法定量检测试剂盒由美国Abbkine公司提供，实验步骤按说明书进行。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。正态分布计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布计量资料采用中位数（范围）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用χ²检验。相关性分析采用Spearman法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 HSP组和健康对照组γδ T及其细胞亚群水平

HSP组PBMCs中淋巴细胞比例、γδ T细胞中Vδ2⁺ T比例低于健康对照组，γδ T细胞中Vδ1⁺ T比例、Vδ1⁺/Vδ2⁺ T比值高于健康对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。两组淋巴细胞中γδ T细胞比例、γδ T细胞中Vδ1^-δ2^- T比例差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1、图 1。

2.2 HSP组和健康对照组γδ T细胞凋亡分析

HSP组γδ T细胞的早期凋亡率（36%±10%）低于健康对照组（49%±8%），差异有统计学意义（t=4.830，P < 0.001）。HSP组总凋亡率（40%±11%）低于健康对照组（55%±8%），差异有统计学意义（t=5.105，P < 0.001）。两组间晚期凋亡率差异无统计学意义（Z=1.044，P=0.297）。

2.3 HSP组和健康对照组IL-17水平比较

HSP组IL-17表达（286±30 pg/mL）高于健康对照组（258±9 pg/mL），差异有统计学意义（t=-4.220，P < 0.001）。

2.4 γδ T细胞总凋亡率、IL-17水平与Vδ2⁺ T细胞表达的相关性分析

外周血Vδ2⁺ T细胞表达与IL-17表达水平呈负相关（r_s=-0.398，P < 0.05），与γδ T细胞总凋亡率呈正相关（r_s=0.615，P < 0.05），见图 2。

3 讨论

HSP是儿童时期常见病，既往研究认为CD4⁺ T细胞作为适应性免疫的重要环节，接受不同抗原抗体刺激后，在不同条件下可分化为不同亚型T细胞参与免疫应答，如Th1/Th2、Treg/Th17免疫失衡^[7]。近年来随着对HSP的深入研究，发现经典CD4⁺/CD8⁺ T平衡理论已不能完全解释其发病机制。本研究进一步将重点定位于γδ T淋巴细胞，通过研究外周血γδ T淋巴细胞及其细胞亚群表达变化、细胞凋亡率和IL-17水平，探讨γδ T淋巴细胞免疫网络失调在HSP病理机制中的调控作用。

γδ T细胞是近20年来新发现的T细胞亚群，主要分布于外周血、脾脏及皮肤和肠黏膜等上皮组织，在宿主防御系统中发挥重要作用。目前多项临床研究显示，在感染^[8]、肿瘤^[9-10]及自身免疫性疾病^[11-12]等方面，患者外周血或组织中可检测出γδ T细胞水平异常，但有关γδ T细胞与HSP免疫发病机制的研究，目前国内外尚无相关文献报道。本研究显示，HSP组外周血淋巴细胞占PBMCs比例低于健康对照组，而淋巴细胞中γδ T细胞比例较健康对照组差异无统计学意义。既往研究证实，γδ T细胞在识别与病原体接触的上皮细胞后迅速向上皮内迁移，提供第一道防线，是宿主防御系统至关重要的环节^[13]。HSP诊断标准中可触性皮疹是必要条件，因此推测患儿外周血中γδ T细胞数目表达正常，但病变皮肤部位γδ T细胞数目可能明显增多。

γδ T细胞几乎是最早出现的T细胞，具有桥接先天性和适应性免疫应答的能力，可识别小分子非肽抗原及主要组织相容性复合体非依赖性抗原，直接溶解靶细胞或发挥吞噬作用，通过Fas/FasL、TNF相关凋亡诱导配体及穿孔素/颗粒酶等途径发挥细胞毒性作用，还可通过改变局部微环境，分泌多种细胞因子和免疫调节因子，调节机体免疫应答反应^{[6, 14]}。多数病例中HSP是自限性的，其中20%~80%儿童出现肾脏受累^[15-16]，γδ T细胞可以通过与T-B细胞共同作用杀伤B细胞，使其产生抗dsDNA抗体明显受到抑制，起到保护肾脏的作用^[17]。本研究显示HSP组外周血γδ T细胞凋亡率降低，这与HSP细胞凋亡紊乱的病理变化一致。HSP存在细胞凋亡失调，其凋亡缺陷是导致HSP的基本病理条件，凋亡过程中可能存在自身抗原被修饰等异常。活化的γδ T细胞可由于TCR的过度刺激或交联，经Fas/FasL途径而凋亡，这可能是γδ T细胞维持免疫自稳的一种机制。

根据Vδ的不同区域结构，将γδ T细胞分为Vδ1⁺及Vδ2⁺两种主要亚型。Vδ1⁺ T细胞主要分布在皮肤和肠黏膜上皮组织中，而Vδ2⁺ T细胞主要存在于外周血液循环和淋巴系统中，Vδ2链几乎完全与Vγ9（也称为Vγ2）配对，激活主要通过TCR依赖的小分子焦磷酸化物，大多在出生后1年内活化并分化为记忆细胞，甚至在脐血中已存在相当比例的非初始细胞，而这部分细胞可能针对自身发生免疫反应^{[9, 18]}。血液中Vδ2⁺ T和Vδ1⁺ T细胞亚群的补偿性变化表明了γδ T细胞稳态的平衡机制，其平衡对于维持机体内环境稳定，预防免疫性疾病发挥着重要作用。以系统性红斑狼疮为例，患者病变皮肤部位γδ T细胞明显增多，主要表达Vγ9δ2 T细胞，多见于受累的基底细胞层，但同时在患者外周血中表达降低，可能涉及该细胞向皮肤和/或黏膜外渗^{[11, 19]}。Tham等^[12]在研究类风湿关节炎与外周血γδ T细胞相关性时发现Vδ2⁺/Vδ1⁺ T比例下降，且主要与Vδ2⁺ T比例降低有关。相关研究也证实，Vδ1⁺/Vδ2⁺ T失调与自身免疫性疾病、炎症性和过敏性疾病存在关联^{[11, 20-22]}。本研究HSP组外周血γδ T细胞中Vδ2⁺ T细胞比例降低，Vδ1⁺ T细胞比例升高，存在Vδ1⁺/Vδ2⁺ T免疫失调，即Vδ1⁺/Vδ2⁺ T比例失调，且Vδ2⁺ T细胞诱导的免疫耐受被打破是导致HSP免疫紊乱的重要原因，进一步揭示了HSP免疫功能紊乱的状态，其原因可能与病理状态下外周血Vδ2⁺ T细胞迁徙至组织有关。

此外，γδ T细胞可进一步通过分泌IL-17、IFN-γ等细胞因子激活JAK-STAT或Ras等信号通路，下调淋巴细胞比例改变免疫微环境。而HSP患儿存在IL-10、IFN-γ及IL-17分泌紊乱，其中以IL-17促炎因子为著。IL-17能够诱导一些其它趋化因子及细胞因子的产生并发挥生理功能，主要由Th17细胞产生，γδ T细胞、NKT细胞、CD8⁺ T细胞等亦可产生^[23]。γδ T细胞作为IL-17重要来源之一，维持其产生不足和过度产生之间的精细平衡^[8]。本研究中HSP组IL-17水平较健康对照组升高，提示IL-17在HSP发生和发展中有重要作用，γδ T细胞分泌IL-17的信号通路可作为未来研究方向及潜在治疗靶点。

综上，本研究证实HSP患儿存在γδ T细胞免疫失调及凋亡失调，表现为Vδ1⁺/Vδ2⁺ T分化失衡，并与γδ T细胞凋亡趋势相关；IL-17水平升高与Vδ2⁺ T细胞比例降低相关。Vδ2⁺ T诱导的免疫耐受被打破，可能是疾病发生的重要病理生理基础。期待今后动态观察治疗前后γδ T细胞的变化及不同临床表型HSP的γδ T细胞差异，进一步系统性研究其在HSP发生发展及治疗中所起的作用，并通过阻断或加强某关键性调控因子调节Vδ2⁺ T细胞数量和功能，扶正γδ T细胞相关亚群失衡理论，可为HSP发病机制提供新的依据与方向，为相关免疫治疗开拓更为广阔的前景。