新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是一种儿科常见病，且近年来在发展中国家的发病率有所上升^[1]，HIE可导致多种后遗症，给国家和社会带来沉重负担^[2]。因此，寻找HIE有效的治疗方案具有重要意义。研究表明，激活内源性神经干细胞（neural stem cells, NSCs）的增殖，可促进神经再生，有助于损伤后神经修复，具有神经保护作用^[3]。褪黑素是松果体分泌的一种神经保护剂，可通过血脑屏障治疗中枢神经系统疾病^[4-5]。本课题组前期研究发现，单剂量即刻褪黑素治疗（single dose immediate treatment, SDIT）可促进脑缺血再灌注损伤大鼠内源性NSCs增殖^[6]，但其对缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）新生大鼠脑NSCs的影响尚未见报道，鉴于新生大鼠脑NSCs在外界刺激后可激活，且具有较强的神经再生能力，推测褪黑素极有可能促进HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖。另有研究发现7日连续褪黑素治疗（7 days continuous treatment, 7DCT）可减轻局灶性脑缺血损伤^[7]，但7DCT对新生大鼠HIBD的影响尚未见报道，且SDIT与7DCT两种方案治疗HIBD新生大鼠疗效的差异尚未阐明，故本研究通过观察SDIT与7DCT两种不同褪黑素治疗方案对新生大鼠HIBD及内源性NSCs增殖的影响，以期寻求褪黑素治疗HIBD的较优方案，为褪黑素治疗的临床应用提供科学的理论依据。

96只健康7日龄Sprague-Dawley（SD）新生大鼠，雌雄不限，平均体重11.9±1.4 g，由山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）20140007。采用随机数字表法随机分为正常对照组、HIBD组、SDIT组及7DCT组（n=24）。每组再分为造模后7 d（n=16）、28 d（n=8）两个亚组，7 d亚组行组织学（n=8）与Western blot检测（n=8），28 d亚组行苏木精-伊红（HE）与尼氏染色（n=8）。正常对照组不予任何处理，SDIT组于HIBD后30 min，按10 mg/kg剂量行腹腔注射褪黑素（美国Sigma公司），7DCT组于HIBD后30 min，给予10 mg/kg剂量褪黑素腹腔注射，连续腹腔注射褪黑素7 d，每天1次。

采用经典Rice-Vannucci法建立HIBD大鼠模型^[8]，乙醚吸入麻醉，剪开颈部皮肤并分离出右侧颈总动脉，电凝笔（美国Roboz公司）电凝右侧颈总动脉，放入低氧舱（武汉七0一研究所）内缺氧2 h后再放置于母鼠笼中喂养，舱内氧气浓度为8%±0.01%。

各组分别在造模后7 d、28 d取新生大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，断头取脑，4%多聚甲醛固定过夜，常规方法包埋，石蜡切片机（Shanton公司，英国）行冠状位切片，每4~5张脑组织切片取1张，厚度约为5 μm。

HIBD后7 d，各组取8只大鼠脑组织，每个脑组织随机取5~6张切片，石蜡切片脱蜡至水，热修复抗原，正常山羊血清封闭后，弃掉封闭液，加入鼠抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA，北京中杉金桥生物技术有限公司，1 : 100）与兔抗巢蛋白（Nestin，武汉博士德生物工程有限公司，1 : 75）一抗混合液，4℃孵育过夜。次日，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，滴加Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1 : 100）和Alexa Fluor 594标记的山羊抗鼠IgG（1 : 100）荧光二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）混合液，37℃避光孵育1 h后，0.01 mol/L PBS冲洗，含6-二脒基-2-苯基吲哚（4' , 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的荧光封片剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）封片。每张切片随机取5个视野，研究级正置荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察、拍照并计数脑组织海马齿回状（dentate gyrus, DG）区和侧脑室室管膜下区（subventricular zone, SVZ）PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数。

HIBD后28 d，各组取大鼠脑组织切片，石蜡切片脱蜡至水，苏木素（上海碧云天生物技术有限公司）染核1~2 min，双蒸水冲洗后盐酸乙醇分色，再次冲洗后滴加1%伊红染料1~2 min。70%、80%乙醇中浸泡数秒后置于无水乙醇中脱水5 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明10 min，中性树胶封片。正置于光学显微镜下观察各组大鼠海马CA1区组织病理学改变并拍照。

HIBD后28 d，各组取8只大鼠脑组织，每个脑组织随机取5~6张切片。石蜡切片脱蜡至水，滴加0.1%甲苯胺蓝后放入60℃烤箱孵育1~2 min，双蒸水冲洗，依次70%、80%、95%乙醇中浸泡数秒，镜下观察细胞核呈淡蓝色后放入无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。正置光学显微镜下观察，每张切片随机选取5个视野，计数脑组织海马CA1区锥体细胞数。

HIBD后7 d，各组大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，生理盐水灌注取脑，取每只大鼠右侧前囟前1.0~-4.5 mm新鲜脑组织，加入组织裂解液提取总蛋白并进行蛋白浓度测定，取60 μg蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗Nestin（1 : 1 000）、鼠抗GAPDH（内参，美国Cell Signaling Technology公司，1 : 2 000）一抗后，4℃孵育过夜。次日，0.01 mol/L的PBS液洗膜后，分别加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗，室温孵育1 h，电化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL，美国Thermo公司）法显色，化学发光凝胶成像系统（美国ProteinSimple公司）曝光并拍照，计算Nestin与GAPDH光密度的比值作为Nestin蛋白的相对表达量，并行统计学分析。

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

HIBD后7 d，正常对照组脑组织DG区及SVZ均有大量PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数表达；HIBD组脑组织DG区及SVZ PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数较正常对照组明显减少（P < 0.01）；SDIT组及7DCT组脑组织DG区及SVZ PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数均较HIBD组明显增多，但仍少于正常对照组（P < 0.01），且7DCT组脑组织DG区及SVZ PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数多于SDIT组（P < 0.01）。见图 1~2。

图 1 不同褪黑素治疗方案对大鼠脑组织DG区及SVZ PCNA+Nestin+DAPI+细胞数表达的影响（免疫荧光染色，×400） PCNA标记增殖细胞，胞核染为红色；Nestin为神经丝蛋白，胞质染为绿色；DAPI标记所有细胞核，核染为蓝色；PCNA+Nestin+DAPI+细胞为增殖的神经干细胞。正常对照组脑组织DG区及SVZ均可见大量PCNA+Nestin+DAPI+细胞，HIBD组阳性细胞较少，SDIT组和7DCT组阳性细胞均较HIBD组增加，且7DCT组较SDIT组增加更显著。

图 2 各组大鼠脑组织DG区及SVZ PCNA+Nestin+DAPI+细胞数比较（n=8） a示与正常对照组比较，P < 0.01；b示与HIBD组比较，P < 0.01；c示与SDIT组比较，P < 0.01。

HIBD后7 d，正常对照组见大量Nestin蛋白表达，HIBD组Nestin蛋白的表达明显下降，且显著低于正常对照组（P < 0.01）；SDIT与7DCT组Nestin蛋白的表达均较HIBD组升高（P < 0.01），但仍低于正常对照组（P < 0.05），且7DCT组Nestin蛋白的表达显著高于SDIT组（P < 0.05）。见图 3。

图 3 不同褪黑素治疗方案对Nestin蛋白表达的影响 上图为各组Nestin蛋白表达的Western blot条带图。下图为各组Nestin蛋白相对表达水平比较柱形图（n=8），a示与正常对照组比较，P < 0.05；b示与HIBD组比较，P < 0.05；c示与SDIT组比较，P < 0.05。

HIBD后28 d，正常对照组新生大鼠海马CA1区锥体细胞数目多，细胞排布整齐、规则，细胞形态及结构正常；HIBD组海马CA1区锥体细胞数目少，细胞排布稀疏、紊乱，细胞形态大小不一；SDIT组及7DCT组海马CA1区锥体细胞均排列较规则，细胞形态及结构均较正常，但锥体细胞数目仍均少于正常对照组。见图 4。

图 4 不同褪黑素治疗方案对海马CA1区的影响 苏木精-伊红染色（×400）结果：正常对照组细胞形态规则、排列整齐；HIBD组细胞形态不规则、排列紊乱；SDIT组细胞形态较规则、排列有序；7DCT组细胞排列规则，细胞形态及结构较正常。尼氏染色（×400）结果：正常对照组见大量锥体细胞；HIBD组锥体细胞数较少；SDIT组与7DCT组锥体细胞数均显著多于HIBD组，且7DCT组显著多于SDIT组。

HIBD后28 d，正常对照组新生大鼠海马CA1区锥体细胞数量最多，排布整齐，细胞大且圆；HIBD组海马CA1区锥体细胞数量最少，排布无规律，形态不规则，锥体细胞数目显著少于正常对照组（P < 0.01）；SDIT组及7DCT组海马CA1区锥体细胞排列较整齐，形态较规则，锥体细胞数量均显著多于HIBD组（P < 0.01），但仍少于正常对照组（P < 0.05），且7DCT组锥体细胞数量多于SDIT组（P < 0.05）。见图 4~5。

图 5 各组大鼠海马CA1区锥体细胞数比较（n=8） a示与正常对照组比较，P < 0.05；b示与HIBD组比较，P < 0.01；c示与SDIT组比较，P < 0.05。

HIE严重威胁着新生儿的生命，是科学工作者研究的重点^[9]。褪黑素作为一种神经保护剂，有研究发现褪黑素SDIT方案治疗可减轻新生大鼠的HIBD^[10]，还有研究发现褪黑素SDIT方案治疗可减轻成年大鼠的脑缺血再灌注损伤^[11]。对于新生儿而言，缺氧、缺血所导致的弥漫性脑损伤与成年人局灶性脑缺血再灌注不同，局灶性脑缺血再灌注损伤治疗时间窗较短，SDIT可达到最佳治疗效果，但新生儿的大脑正处于发育过程中，具有更强的再生潜能，与SDIT相比，我们推测7DCT更能促进HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖，且7DCT与实际临床治疗方式贴合更加紧密。故本研究比较SDIT与7DCT两种不同褪黑素治疗方案对HIBD新生大鼠的影响，以期为褪黑素治疗HIE提供科学的理论依据。

神经再生是新生儿HIBD后神经修复的重要基础。NSCs在脑内终生存在，主要见于DG区和SVZ^[12]。本研究利用Nestin/PCNA免疫荧光双重标记增殖的NSCs，发现HIBD后7 d，HIBD组脑组织DG区及SVZ均可见少量增殖的NSCs，提示HIBD本身可促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖，但由于HIBD导致脑内微环境改变，NSCs的增殖能力是有限的，褪黑素能否放大内源性NSCs的增殖，以及SDIT与7DCT两种治疗方案疗效的差别是本研究的重点。本研究发现：SDIT组及7DCT组脑组织DG区及SVZ增殖的NSCs均较HIBD组增多，但均仍少于正常对照组，表明SDIT与7DCT方案均可以促进DG区与SVZ内源性NSCs的增殖，提示褪黑素可促进内源性NSCs的增殖，放大内源性神经再生；同时，本研究还发现7DCT组DG区及SVZ的NSCs增殖比SDIT组增加更显著，提示7DCT方案更亦促进内源性NSCs的增殖。为验证本推测，本研究采用Western blot法观察SDIT与7DCT方案对Nestin蛋白表达的影响，发现两种褪黑素治疗方案均对NSCs具有神经保护作用，且7DCT对NSCs的保护作用更佳，其机制可能与褪黑素促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖有关，具体机制目前正在进一步的研究当中。

海马是与学习记忆相关的重要脑区，海马CA1区更是HIBD后损伤易感区^[13]。HE染色和尼氏染色是脑损伤远期组织学评估的常用方法，本研究采用HE与尼氏染色两种方法观察不同褪黑素治疗方案对HIBD新生大鼠脑组织海马CA1区锥体细胞的影响，发现HIBD后28 d，正常对照组海马CA1区锥体细胞数量最多，排布整齐，细胞大且圆；HIBD组脑组织海马CA1区锥体细胞数目最少，细胞排布稀疏、紊乱，细胞形态大小不一，锥体细胞数量少于正常对照组，这与文献报道一致^[12]，提示模型造模成功；SDIT与7DCT组脑组织海马CA1区锥体细胞较整齐，形态较规则，锥体细胞数目均高于HIBD组，且7DCT组脑组织海马CA1区锥体细胞数多于SDIT组，但仍少于正常对照组，提示两种褪黑素治疗方案均能减轻HIBD新生大鼠海马CA1区锥体细胞的损伤，且7DCT方案治疗HIBD新生大鼠疗效较佳，其机制可能与褪黑素治疗可促进内源性NSCs的增殖有关，其相关分子信号机制尚有待于进一步研究。

总之，两种褪黑素治疗方案均可促进HIBD新生大鼠脑内源性NSCs的增殖，减轻HIBD，7DCT方案疗效较优，从而为褪黑素治疗HIBD的临床应用提供了科学的理论依据。