2020, Vol. 22
2. 青岛大学生物化学与分子生物学实验室, 山东 青岛 266000
神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤[1]，大量研究揭示了人类神经母细胞瘤的分子特征，包括基因组、表观基因组和转录组水平的异常[2]。约25%的NB患儿存在MYCN基因扩增，而MYCN基因的扩增和高危型风险分组、预后差有关[3]。自MYCN扩增被发现以来，越来越多的MYCN扩增型NB分子机制得到了阐释。MYCN编码的mRNA和其表达的蛋白质，参与多个基因的调控，如MYCN编码的转录因子N-myc调节下游p53、S期相关蛋白激酶2（S-phase associated kinase 2, SKP2）、双微体2（murine double minute 2, MDM2）等基因，还调节一些微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）的表达[4]。而许多基因的失调，也可导致MYCN的扩增。虽然MYCN扩增型NB的分子机制一直是研究热点，但机制非常复杂，至今仍不明确。
MYCN扩增是NB预后不良的标志[5]，但MYCN扩增型NB患者的5年生存率也可达50%[6]。所以需要确定新的生物标志物，以便更好地进行风险分层，并进一步深入了解NB的生物学基础。本文将MYCN扩增型NB和MYCN非扩增型NB表达的mRNA相比较，初步探究这些差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）的功能，并进一步筛选影响MYCN扩增型NB预后的基因，评估这些基因对其预后的预测价值。
1 资料与方法 1.1 数据来源NB患儿临床资料和基因数据均来自TARGET数据库（https://ocg.cancer.gov/programs/target）。共获取154例NB患儿的数据，其中女63例，男91例；诊断年龄3 d至16.5岁，中位诊断年龄为2.9岁。根据国际NB分期系统（International Neuroblastoma Staging System, INSS）分期，Ⅱb期1例，Ⅲ期6例，Ⅳ期126例，Ⅳ-s期21例；根据儿童肿瘤组（Children's Oncology Group, COG）危险分层，高危型127例，中危型13例，低危型14例。RNA转录组数据来自TARGET数据库中RNA测序数据，共包括18 911个mRNA。根据NB患儿有无MYCN扩增分为MYCN扩增组（n=33）和MYCN非扩增组（n=121）。
1.2 差异表达分析采用edgeR 3.9（http://www.bioconductor.org/pa-ckages/release/bioc/html/edgeR.html）识别MYCN扩增组与MYCN非扩增组间DEGs[7]。使用multtest 2.36.0（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/multtest.html）将P值调整为假发现率（false discovery rate, FDR）[8]；以FDR < 0.05和差异倍数（fold change, FC）的对数绝对值（|logFC|） > 1为差异有统计学意义。
1.3 功能富集分析和信号转导通路分析应用DAVID Bioinformatics Resources 6.8数据库（http://david.ncifcrf.gov）进行Gene Ontology（GO）功能分析和KEGG信号转导通路富集分析，并在Cytoscape中使用BiNGO插件预测潜在的功能[9]。FDR < 0.05为差异有统计学意义。
1.4 统计学分析应用SPSS 22.0和R 3.6.0软件进行数据处理。计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验。非正态分布计量资料以中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型（简称Cox回归模型）分析影响MYCN扩增型NB患儿预后的基因。根据多因素Cox回归模型分析的结果，计算风险评分。风险评分=基因表达量×多因素Cox回归系数，是预测预后的指标。根据Akaike信息准则（Akaike information criterion, AIC），AIC值越小，模型越好。多因素Cox回归模型分析得到的基因，风险评分最低[10]。按风险评分的中位值将患儿分为高风险组和低风险组，采用R软件的survminer包绘制生存分析曲线。ROC曲线分析基于DEGs的风险评分对MYCN扩增型NB预后的预测价值。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MYCN扩增组和MYCN非扩增组一般情况比较两组间患儿诊断年龄、性别、INSS分期差异无统计学意义（P > 0.05）。MYCN扩增组COG危险分层中高危型患儿比例高于MYCN非扩增组（P < 0.05）。见表 1。
| 表 1 MYCN扩增组和MYCN非扩增组一般资料比较 |
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与MYCN非扩增组比较，MYCN扩增组共发现582个DEGs，其中206个DEGs表达上调，376个DEGs表达下调。部分DEGs见表 2。
| 表 2 MYCN扩增组与MYCN非扩增组中部分DEGs |
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GO功能富集分析结果表明，上调的DEGs主要富集在翻译起始（44个）、蛋白质转移（40个）、核糖体（40个）、细胞外基质构成（19个）等（图 1A）；表达下调的DEGs，主要富集在质膜蛋白复合物（34个）、突触组织（32个）、神经递质水平（28个）、受体调节活性（25个）和抗原处理和呈递（18个）等（图 1B）。
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图 1 DEGs的GO分析 图A为上调DEGs的GO富集分析结果，图B为下调DEGs的GO富集分析结果。 |
KEGG信号转导通路分析，上调的DEGs主要涉及核糖体（41个）、蛋白质的消化和回收（8个）等（图 2A），而细胞黏附分子（27个）、类风湿关节炎（19个）等是表达下调基因参与的主要通路（图 2B）。
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图 2 DEGs的KEGG分析 图A为上调DEGs的KEGG分析结果，图B为下调DEGs的KEGG分析结果。 |
以|logFC| > 2为条件，进一步筛选得到89个差异表达的mRNA。经单因素Cox回归模型分析，发现15个基因的mRNA对MYCN扩增型NB预后产生显著性影响（P≤0.05），分别为FLVCR2、FAM49A、PKIB、SCN7A、C17orf107、RGS9、INSRR、PRSS12、NTRK1、CRABP1、MBP、RP11-566K11.2、ERBB3、XAGE1A和XAGE1B，见表 3。
| 表 3 影响MYCN扩增型NB预后的单因素Cox回归模型分析 |
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对单因素分析结果中差异具有统计学意义的15个基因进行多因素Cox回归模型分析，发现5个基因的mRNA可用于预测MYCN扩增型NB的预后，分别为FLVCR2、SCN7A、PRSS12、NTRK1、XAGE1A，见表 4。
| 表 4 影响MYCN扩增型NB预后的单因素Cox回归模型分析 |
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基于AIC，多因素Cox回归模型分析得到的FLVCR2、SCN7A、PRSS12、NTRK1和XAGE1A的风险评分最低，为预测预后的最佳生物标志物。根据风险评分的中位值将患儿分为高风险组和低风险组。两组间患儿诊断年龄、性别差异无统计学意义（P > 0.05）；高风险组INSS分期中Ⅳ期患儿比例及COG危险分层中高危型患儿比例均高于低风险组（P < 0.05）。见表 5。生存分析发现，高风险组的总生存率明显低于低风险组（P < 0.05），见图 3。
| 表 5 高风险组和低风险组患儿一般资料的比较 |
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图 3 高风险组和低风险组生存曲线 |
基于5个mRNA的风险评分的ROC曲线下面积为0.729（95%可信区间：0.650~0.808，P < 0.001），当约登指数为0.376时，风险评分的最佳截断值为1.316，灵敏度为53.2%，特异度为84.4%, 阴性预测值为84.4%，阳性预测值为53.2%，见图 4。
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图 4 基于5个mRNA风险评分预测MYCN扩增型NB预后的ROC曲线 |
本研究发现MYCN扩增型NB和MYCN非扩增型NB在基因表达上有许多不同，因此存在很多差异明显的mRNA。这些mRNA与MYCN扩增关系密切。虽然MYCN扩增与预后不良相关，但研究发现MYCN无法作为靶向治疗的直接靶标，需要找寻其他有效靶标[11]。而本研究为未来进一步研究NB的分子靶标提供参考。经过DEGs功能分析，初步探讨了促进MYCN扩增型NB发生的分子机制。本研究发现，FLVCR2、SCN7A、PRSS12、NTRK1、XAGE1A基因对MYCN扩增组NB患儿预后具有显著性影响，基于上述5个mRNA的风险评分对MYCN扩增组NB患儿预后有预测价值，故这5个mRNA可以作为MYCN扩增型NB的预测预后的生物标志物。
在GO分析中，上调的DEGs生物功能主要富集在蛋白质的翻译以及转运至膜的过程，细胞构成主要富集在核糖体，分子功能主要富集在核糖体和细胞外基质的结构组成，KEGG结果也显示上调的DEGs主要参与了核糖体通路的表达。因此，可以预测，MYCN扩增型NB的核糖体功能表达更加活跃，蛋白质的的翻译和转移也更加高效。而已有研究表明，MYCN扩增的NB细胞真核转录延长[12]。下调的DEGs生物功能主要富集在突触组织，神经递质的转移，分子功能主要富集在膜受体的活动上，由此可知，MYCN扩增型NB神经细胞表达更加活跃，侵袭能力更加强大。而已有研究表明，MYCN扩增促进NB细胞代谢和侵袭[13]。
研究表明，FLVCR2、SCN7A、PRSS12、NTRK1和XAGE1A参与多种生物过程和分子机制。FLVCR2主要促进主要易化子超家族（MFS）的跨膜转运蛋白，参与生长、钙交换和体内平衡的调节[14]；SCN7A/Nax通道可作为体液的钠水平传感器，通过改变神经元兴奋性来控制钠摄入，增强的SCN7A / Nax表达通过增加背根神经节中神经元的兴奋性而导致骨癌疼痛[15]；PRSS12编码的蛋白是由神经细胞分泌的，被认为对认知功能很重要，因为其功能丧失会导致严重的非综合征性精神发育迟滞[16]。高水平的NTRK1/TrkA受体在低阶段NB中表达，NTRK1/TrkA的表达影响NB细胞的免疫原性，其特征在于患者预后良好并且经常发生自发消退[17]。NTRK1还通过表观遗传学来调节NB的分化[18]；有外显子水平分析将MYCN和NTRK1鉴定为替代外显子表达的主要决定因素，并且可以有力地预测原发性NB的预后[19]。XAGE1在头颈部鳞状细胞癌中的表达和预后有相关性，它和GAGE1是头颈部鳞状细胞癌预后的独立危险因素[19]。
自引入RNA测序和表达微列阵以来，使用mRNA表达特征作为个体患者结局的预测因子已成为目前研究的热点。本研究讨论了MYCN扩增型NB和MYCN非扩增型NB表达基因的差别并且筛选出可以预测MYCN扩增型NB预后的5个mRNA，分析了这5个基因作为预后生物标志物的预测价值。目前NB的临床治疗仍然存在很大的挑战，特别是高危患儿，即使运用多种治疗模式，也很难进一步提高生存率[20]。近年来，分子靶向治疗一直是研究热点，原因在于其可以精准地在某个关键环节上发挥作用。本研究通过层层筛选出的基因，也为NB的分子靶向治疗提供了新的素材和思路。
TARGET是大型和全面的癌症基因组数据库，基于这5个mRNA的风险评分是一个稳妥的生存预测模型。但即使通过一系列统计学算法，确定了这5个mRNA可以作为预测预后的生物标志物，临床试验等实验研究仍然是必要的，以避免假阳性的可能。并且需要一系列的实验来揭示这些mRNA在NB中的作用及机制。
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